益母草水苏碱通过促进β-AR快速脱敏效应抑制ISO诱导心肌肥大的作用机制研究

Catecholamine-induced myocardial hypertrophy is induced by the overactivation of the beta adrenergic receptor (β-AR) signal, and rapid desensitization of β-AR by its antagonists has been proved to be beneficial. Recent studies demonstrated that G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and G-protein coupled receptor 62 (GPR62) regulate the membrane translocation of β-arrestin, which is a vital step in rapid β-AR desensitization. Our previous studies have revealed that stachydrines (Sta) reduced cytoplasm cyclic adenosine phosphate (cAMP) content, inhibited protein kinase A (PKA) activity, and therefore blunted calcium handling and hypertonic function induced by the short-term activation of β-AR, accompanied with less Gpr62 transcript. Hence, we hypothesize that Sta increases the rapid desensitization of β-AR via down-regulating GRKs/GPR62/β-arrestins signal, which leads to restrain excessive activation of β-AR signal and ultimately protect heart from Catecholamine-induced myocardial hypertrophy. Isoprenaline induced cardiac hypertrophy mouse model, combined with adult and neonatal mouse cardiomyocytes exposed to isoprenaline, will be applied in this study to discover the effect and target of Sta on β-AR desensitization, calcium handing and contraction in the cardiomyocytes, and cardiac morphological and functional changes.

儿茶酚胺过度激活β-肾上腺素受体(β-AR)信号系统是心肌肥大的主要发病机制之一，而β-AR快速脱敏效应是心肌代偿期的一种自我保护机制。G蛋白耦联受体激酶和G蛋白耦联受体62(GRKs/GPR62)调控β-arrestins膜转位是β-AR快速脱敏效应的核心环节。我们前期研究发现益母草水苏碱(Sta)可抑制Gpr62基因转录，减少环磷酸腺苷(cAMP)含量，降低蛋白激酶A(PKA)活性，抑制β-AR短时激活引起的心肌钙转运及舒缩功能亢进，提高心功能不全模型的心功能。由此推测，Sta可能通过调控GRKs/GPR62信号系统，促进β-arrestins介导的快速脱敏效应，进而抑制β-AR信号系统的过度激活，最终抑制心肌肥大。本项目拟采用ISO诱导心肌肥大模型，结合成年和乳鼠心肌细胞药物和基因干预手段，从受体脱敏效应、心肌细胞效应和心脏功能三个维度，阐明Sta对β-AR信号系统的分子作用靶点。

儿茶酚胺过度激活β-肾上腺素受体(β-AR)信号系统是心肌肥大的主要发病机制之一，而β-AR快速脱敏效应是心肌代偿期的一种自我保护机制。G蛋白耦联受体激酶和G蛋白耦联受体62(GRKs/GPR62)调控β-arrestins膜转位是β-AR快速脱敏效应的核心环节。.研究内容主要有以下三个方面：（1）整体水采用 ISO 微渗透泵植入小鼠皮下制备心肌肥大模型，采用心脏超声、压力容积电导技术、H&E、Masson 及 WGA 染色等方法观察益母草水苏碱对 ISO 诱导小鼠心肌肥大模型心肌结构和心脏功能的作用，发现益母草水苏碱可以抑制ISO 诱导的心肌肥大。（2）利用原代成年小鼠心肌细胞，采用离子成像系统和肌节长度测量系统检测心肌钙转运和舒缩功能，发现评估益母草水苏碱可以抑制β-AR/cAMP/PKA 级联信号转导效应。（3）利用上述实验动物模型，通过蛋白印迹、酶联免疫吸附测定等实验技术，发现益母草水苏碱调控心脏中 β1-AR、cAMP、PKA、GRK2/3、β-arrestin、AP2 和 Rab5/7/11表达；通过组织免疫荧光检测益母草水苏碱对 GRK2/3 和 β-arrestin 膜转位及其与β-AR 共定位，发现益母草水苏碱可以抑制β1-AR与GRK3的结合；培养原代分离的 C57BL/6J成年和新生鼠心肌细胞，利用基因干预手段、免疫荧光、双荧光素酶报告基因系统、细胞内共定位等技术，发现：(1) 益母草水苏碱可以促进 β-AR 的快速脱敏效应；(2) 益母草水苏碱可以降低cAMP的含量，抑制PKA 活性；(3) 采用免疫荧光检测发现益母草水苏碱可以抑制 GRK3、β-arrestin 膜转位，抑制 Rab5/7与 β-AR的结合，促进Rab11与β1-AR的结合，明确益母草水苏碱对 β-AR 快速脱敏效应的调控作用。 .本项目发现益母草水苏碱可显著提高ISO诱导心力衰竭小鼠的心脏功能，促进心衰时β1-AR的表达，初步阐明了益母草水苏碱促进β1-AR表达的分子机制与GRK3\β-arrestins介导的快速脱敏效应相关，进而抑制β-AR信号系统的过度激活，最终抑制心肌肥大。.