功能图案化EQCM生物传感器用于乳腺癌微转移能力和标志物检测的研究

Breast cancer micrometastasis is a serious problem that threatens the lives of breast cancer patients. Its mechanism is far from clear. Tumor cell adhesion, migration and matrix degradation are key scientific problems in the study of tumor micrometastasis. Monitoring of cell adhesion, migration and matrix degradation abilities in real time have been identified as a key technical challenge in tumor micrometastasis studies. Firstly, A impedance model of QCM chip in relation to the viscoelasticity is established, with its multilayer adhesive film in the solution. Then, based on the theoretical analysis of the relationship between the change in frequency and that of the adhesive property, an EQCM piezoelectric electrochemical sensor system will be constructed to continuously track the changes of adhesion characteristics of different breast cancer cells with different tumor marker (integrin αVβ3) expression levels at different growth stages (free, adherent (adherence), spreading and recession) based on the theoretical analysis. The regulatory mechanism of breast cancer cells with different tumor marker expression levels on cell adhesion at different stages will be studied. Furthermore, the mechanism of tumor marker level on the adhesion type (homogeneous and heterogeneity adhesions) and migration ability of breast cancer cells will also be investigated by pattern designing and modifying the surface of the EQCM sensor chip. As well as the preparation and modification of the nanogold-labeled functionalized materials RGD peptide onto the surface-film patterned EQCM sensor chip to investigate the synergistic mechanism of matrix metalloproteinases involved in the degradation of extracellular matrix. The research will provide a more comprehensive scientific guidance for breast cancer metastasis prognosis and clinical treatment.

乳腺癌微转移严重威胁乳腺癌患者的生命安全，其机制尚未明了。肿瘤细胞的粘附能力，迁移能力及基质降解能力变化是肿瘤微转移机制研究中关键的科学问题。连续跟踪检测肿瘤细胞的这些变化是上述科学问题中关键的技术问题。本项目首先拟建立基于溶液中QCM芯片上多层膜的粘附特性检测的阻抗模型，然后在理论分析的基础上，搭建一种EQCM传感器系统，来连续跟踪检测肿瘤标志物(整合素：αVβ3)表达水平不同的乳腺癌细胞在游离、粘附（与贴壁）、铺展和衰退等不同生长阶段粘附能力的变化，研究标志物对细胞粘附能力的调控机制。进一步通过对EQCM传感器芯片表面薄膜的图形化设计和制作，来研究肿瘤标志物对乳腺癌细胞粘附类型与迁移能力的调控机制；以及通过制备纳米金标记的RGD肽修饰到表面薄膜图形化的EQCM传感器芯片上，来研究标志物和基质金属蛋白酶对胞外基质降解能力的影响，从而为乳腺癌转移的预后与临床治疗提供更全面的科学指导。

癌细胞转移是一个多步骤的复杂过程，在肿瘤浸润、转移过程中的关键步骤包括细胞粘附特性的变化、迁移能力的变化、和胞外基质的降解，这些都离不开整合素在此过程中的动态调控。基于生化技术所进行的细胞粘附能力、迁移能力及基质降解能力的检测都以外部生化试剂刺激一定的时间后再检测响应模式。因此，时间节点的选择非常重要。目前的生化检测技术无法实时跟踪整合素在整个肿瘤细胞粘附（与贴壁）、 铺展和衰退等生长过程中如何影响肿瘤细胞转移能力的变化。本项目主要针对上述转移过程的动态性以及时间节点的重要性，搭建一种EQCM传感器系统，来在线为进行乳腺癌微转移能力和标志物检测的机制研究提供测试数据。通过在图案化的传感器表面种植乳腺癌细胞和改变细胞的整合素及基质金属蛋白酶环境，利用搭建EQCM传感器系统来实时获得细胞粘弹特性变化的指纹图谱，为评估整合素avb3抗体在乳腺癌细胞微转移过程中对细胞特性的影响提供科学依据。研究表明整合素avb3抗体对乳腺癌细胞特性的影响是一个动态的过程，发现8小时和15小时是其中两个主要的时间节点。在avb3抗体处理细胞8小时后， PTEN，PAK1，EGFR，VASP，肌动蛋白Pan（a/b/g），丝氨酸a，BAD，连环蛋白β，JNK1/2/3水平显著增强。而 Vinculin、Raf1、p130Cas水平显著降低。而在avb3抗体处理细胞15小时后，PKCα、p44/42 MAPK、Src、FAK、Shc、IGF1R、HER2、c-Jun等水平显著增加，而VAV2、整合素β-1，FAK、EGFR、B-RAF、EGFR、PAK1/2/3、VEGFR1、整合素β-4、FAK、PDGFRα、PKCβ/PKCB等水平显著降低。划痕及共培养后的划痕电化学检测实验也证实乳腺癌细胞在有整合素avb3抗体存在的情况下完成迁移需要的时间从10小时延长到15小时，表明avb3有利于乳腺癌细胞的迁移，而且发现MDA-MB-231细胞和内皮细胞共培养环境中内皮细胞膜电容减少使得MDA-MB-231细胞易转移。另外还制备了一系列的功能化材料修饰生物传感器来进行标志物的检测。