dCK和p8基因相关微小RNA的筛选及其在胰腺癌化疗增敏中的作用研究

对化疗药物耐药是胰腺癌预后不良的重要原因。我们前一项国家自然基金的实验结果证实：胰腺癌细胞中dCK低表达与p8高表达是胰腺癌对化疗药吉西他滨耐药的重要因素。课题组进一步的研究发现，耐药与非耐药细胞的miRNA表达具有显著差异，并且初步筛选出10个与dCK和p8相关的miRNA。但是这些miRNA是否能够调控胰腺癌细胞的化疗耐药性尚不清楚。本课题拟采用miRNA芯片技术筛选耐药和非耐药细胞的差异表达miRNA，进而采用qPCR筛选与dCK低表达和p8高表达相关的miRNA靶点；而后用重组慢病毒技术对其进行调控：在上调dCK表达的同时下调p8的表达。通过检测胰腺癌细胞的药敏曲线、凋亡率、侵袭力等验证所选miRNA对胰腺癌细胞化疗敏感性的调控作用。最后采用miRNA重组慢病毒瘤体注射和吉西他滨尾静脉注射的方法，在裸鼠种植瘤模型上验证miRNA的作用。以期为胰腺癌的化疗增敏研究探索可能的靶点。

对化疗药物耐药是胰腺癌预后不良的重要原因。我们前一项国家自然基金的实验结果证实：胰腺癌细胞中dCK低表达与p8高表达是胰腺癌对化疗药吉西他滨耐药的重要因素。课题组进一步的研究发现，耐药与非耐药细胞的miRNA表达具有显著差异，并且初步筛选出10个与dCK和p8相关的miRNA。但是这些miRNA是否能够调控胰腺癌细胞的化疗耐药性尚不清楚。在此项研究中，我们首先筛选出了耐药与非耐药胰腺癌细胞株，采用Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 Array芯片对两株细胞的miRNA进行分析，筛选出差异表达miRNA。在对芯片结果进行生物信息学分析后发现，在显著性GO和Pathway所属的基因里并没有DCK或者p8。反向预测DCK或者p8相关的miRNAs，并与芯片检测出的差异miRNA取交集，共筛选出miRNA 17个，其中能同时调控DCK和P8的miRNA共3个，分别为miR-329，miR-452-5p与miR-654-5p。用相应浓度的吉西他滨分别处理不同的胰腺癌细胞24h，48h及72h后，采用RT-PCR的方法检测miRNA的表达变化， miR-432-5P和miR-487b的水平在吉西他滨处理72h后发生较为明显变化，提示mir-432-5p,mir-487b可能与吉西他滨的药物应答有关。过表达miR-432-5p及miR-487b后capan-2对吉西他滨的敏感性增强，而抑制后对药物的应答减弱。通过检测mirna过表达或者干扰前后细胞内caspase3/7的酶活性的实验提示，miRNA的水平变化可以通过影响细胞的凋亡引起药物应答的变化。RT-PCR的方法检测miR-432-5P及miR487b过表达或者抑制之后各预测靶基因的变化，IGF1R的变化较为明显。我们还检测了mir30a的情况，过表达mir30a后Capan-2细胞对吉西他滨敏感性显著增强，增殖能力明显下降，G0/G1期减少，S期期细胞增多，G2期细胞减少。IRS-1的表达明显减弱，提示IRS-1可能为mir30a的直接靶基因。p-Erk水平显著下调，p-Akt水平亦下调，提示药物应答能力的改变可能与IRS-1下游蛋白Erk，Akt的活化有关。通过此项研究，我们初步找到了能够显著影响胰腺癌细胞耐药性的miRNA，其可能通过PI3K/Akt和MAPK通路调控胰腺癌细胞的耐药性。