HRE调控VEGF基因转染NSCs治疗新生大鼠HIBD的实验研究

在已证实NSCs移植可明显改善神经功能的研究基础上，构建具有缺氧诱导特性、高表达VEGF的基因工程NSCs，经real time-PCR、免疫荧光染色、Western、激光共聚焦显微镜技术检测转基因NSCs的VEGF基因表达情况，体外实验分析HRE调控VEGF基因在缺氧神经干细胞表达。体内实验建立新生大鼠HIBD模型，大脑皮层立体定向移植转基因NSCs，观察移植后NSCs的存活、迁移与分化，评估治疗后大鼠神经行为学及感觉运动功能，定量检测鼠脑VEGF基因、蛋白的表达及其生物学效应。本项目将神经干细胞移植与基因治疗相结合，对HIBD的治疗研究进行全新的探索，利用基因工程修饰体外培养携带外源VEGF基因修饰的NSCs脑内移植治疗新生大鼠HIBD，有望实现变性坏死区神经的修复，以期能为脑再生医学开辟新路径。

构建携带VEGF165基因的两种重组慢病毒载体pGC-FU-VEGF165，9HRE-pGC-FU-VEGF165，将两者分别转染体外分离培养的NSCs细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率，Western Blot蛋白定量、MTT等实验验证慢病毒质粒转染NSCs后能够稳定表达VEGF165基因，并能促进NSCs的增殖，且在缺氧时受HRE启动子作用，能提高VEGF基因的表达，随缺氧时间的改变HRE可对VEGF表达水平进行调控。体内实验建立新生大鼠HIBD动物模型，大脑皮层立体定向注射缺氧诱导特性的高表达VEGF的基因工程NSCs，评估治疗后大鼠神经行为学功能恢复情况，检测移植后VEGF蛋白的表达及其生物学效应。证实缺氧诱导特性的高表达VEGF的基因工程NSCs治疗可增加鼠脑VEGF蛋白的表达，减少脑组织梗塞面积, 改善脑损伤后的远期行为学功能，减轻缺氧缺血后的脑损伤，具有神经保护作用。本项目对HIBD的治疗研究进行了全新的探索。