钙离子介导的NOX对T-2毒素诱导马铃薯块茎ROS积累的调控机理研究

Calcium ion plays an important role in adjusting the activity of NOX, plasma membrane NADPH oxidase (PM-NOX) has involved in reactive oxygen species (ROS) accumulation and resistance against dry rot induced by T-2 toxin at low concentration in potato tuber. However, the types of PM-NOX, activities, and function in ROS production remain unknown. In this proposal, potato tubers are chosen as material, microscopy observation, biochemistry analysis, RT-PCR detection, isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)-LC-MS/MS and Western blot are employed to reveal the types of PM-NOX gene and proteins implicated in ROS accumulation in potato tubers induced by T-2 toxin and calcium ion with the help of the multidisciplinary approaches involving the postharvest pathology, cell biology, physiological and biochemistry, and molecular biology at the level of molecular, biochemistry and cellular to explain the mechanism of ROS accumulation mediated by PM-NOX and proteins of plasma membrane involved in ROS accumulation. The objects of this proposal can provide theory basis of the function of ROS signal transduction in potato tuber by T-2 toxin.

钙离子对质膜NADPH氧化酶（PM-NOX）活性具有调节作用，而PM-NOX参与了低浓度T-2毒素诱导马铃薯块茎活性氧（ROS）积累和对干腐病的抗性，但参与该过程的PM-NOX种类、活性以及在质膜ROS积累中的作用尚不明了。本研究拟选用马铃薯块茎为试材，综合采后病理学、生理生化、细胞生物学和分子生物学等多学科的方法，通过T-2毒素结合Ca2+处理，利用显微观察、生化测定、实时定量PCR（RT-PCR）、iTRAQ结合LC-MS/MS、Western blot蛋白质免疫印迹等技术，在分子、生化和细胞水平上解析参与T-2毒素诱导块茎质膜ROS积累的PM-NOX的基因类型及蛋白种类，明确PM-NOX参与T-2毒素诱导马铃薯块茎质膜ROS积累的分子机制，为进一步揭示质膜ROS积累在T-2毒素诱导马铃薯块茎抗病反应中信号转导机制奠定理论基础。

由镰刀菌引起的干腐病是马铃薯块茎的主要采后病害，感病块茎体内会产生单端孢霉烯族T-2毒素。我们前期研究发现，T-2毒素诱导的马铃薯块茎抗病性与活性氧代谢密切相关，但详细作用机理不明。本研究以“陇薯3号”马铃薯块茎为试材，用T-2毒素结合CaCl2及钙螯合剂EGTA处理，研究不同处理对块茎损伤接种Fusarium sulphureum病斑直径的影响，分析了处理对块茎质膜NADPH氧化酶NOX活性及不同基因家族StNOX表达的影响，研究了处理对块茎活性氧代谢相关酶活性及代谢产物含量的影响，通过i-TRAQ从质膜蛋白组学和q-PRC从转录组学的角度进行了验证。结果表明：.1. 钙处理在一定程度上抑制了对照及T-2毒素处理块茎病斑的扩展。钙处理提高了块茎质膜上NOX活性，促进了块茎质膜ROS的积累，上调了StNOXB基因表达。钙处理维持了块茎细胞膜的完整性，显著提高了NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶的活性，增加了T-2毒素处理块茎的O2-.产生速率和H2O2含量。EGTA处理显著降低了细胞膜的完整性，以及块茎中O2-.的产生速率和H2O2含量，抑制了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及过氧化物酶的活性。钙处理对抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢相关酶活没有显著影响，但不同程度增加了代谢产物的含量。q-PCR结果表明，钙处理提高了对照及T-2毒素处理块茎的ROS代谢相关基因表达。.2. iTRAQ的分析结果表明，T-2毒素处理诱导了86个发生蛋白差异表达。这些蛋白主要涉及代谢、防卫反应、蛋白合成、能量途径、信号转导、转录及其它等七种功能，其中参与活性氧代谢与防卫反应相关蛋白（如：monodehydroascorbate reductase-like，peroxidase 72-like，peroxidase 12-like等）病程相关蛋白（如pathogenesis-related protein STH-2-like，pathogenesis-related protein P2-like precursor等）被鉴定发生不同程 .度上调；同时一些与能量代谢相关蛋白也可能参与了马铃薯块茎抗干腐病反应。.综上所述，钙处理增强了T-2毒素诱导的块茎抗病性，提高了块茎质膜NOX活性，该作用与维持细胞膜完整性，增强块茎活性氧代谢相关酶的活性，促进抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和还原型谷胱甘肽的积累相关。