转录因子Vrf1调控稻瘟病菌附着胞细胞壁形成的分子机制研究

Rice blast is a primary fungal epidemic disease in rice, and it damages the food security heavily in our country. The rice blast fungus (Magnaporthe oryzae) invades rice through a special cell called an appressorium and causes the rice blast disease. From gene-deletion mutants of 300 transcription factor genes in M. oryzae, we identified a C2H2 domain transcription factor gene VRF1, which functions in appressorium formation specifically. After deletion, the VRF1-null mutant Δvrf1 still displayed normal in colony growth, conidiation, and early appressorium formation, but its appressorium did not develop into a mature melanized appressorium. And the mutant Δvrf1 lost its virulence to rice. This project is aimed at the function and underlying gene regulatory network of VRF1 in the appressorial cell-wall formation and pathogenicity. We are going to use RNA-Seq、qPCR、EMSA、yeast one-hybrid assay and ChIP-qPCR to study the regulatory role of VRF1 on genes relative to melanin, chitin, and glucan metabolism. And we also will use yeast two-hybrid assay, Co-IP and BiFC to analyze the coordination between Vrf1 with transcription factors Con7 and MoHox7 in regulating the appressorial cell-wall formation. This research will further our understanding of the mechanism of appressorium development and pathogenicity of M. oryzae, which is important to the prevention of rice blast disease.

稻瘟病是一种重要的水稻真菌病害。稻瘟病菌通过附着胞（一种特殊的细胞）侵入水稻从而致病。从300个稻瘟病菌转录因子的敲除突变体中，课题组筛选到1个专一作用于附着胞成熟阶段的转录因子VRF1。VRF1敲除突变体的生长、产孢和早期的附着胞形态都正常，但成熟附着胞细胞壁缺乏黑色素而且形态异常，丧失了对水稻的致病力。本项目将继续研究VRF1在附着胞细胞壁发育和致病过程中的作用，通过RNA-Seq、EMSA、酵母单杂交和ChIP-qPCR等技术研究VRF1对黑色素、几丁质和葡聚糖代谢途径基因的调控作用，通过酵母双杂交、Co-IP 和BiFC等技术研究Vrf1与其他转录因子Con7和MoHox7对附着胞细胞壁基因的协同调控作用。预期成果：阐明VRF1在附着胞细胞壁形成和致病中的功能，明晰VRF1介导的附着胞细胞壁形成基因的调控网络。研究成果对于揭示附着胞的形成机制和稻瘟病防治具有重要参考价值。

稻瘟病是一种由丝状真菌-稻瘟病菌-引起的病害，威胁水稻、小麦等禾本科粮食作物的安全生产，严重年份可以导致大规模绝产。稻瘟病菌通过附着胞侵染水稻。附着胞是由孢子萌发的芽管在植物表面信号诱导下分化产生的一种特殊细胞。结构和功能正常的附着胞是稻瘟病菌能否侵染水稻的关键。关于附着胞的研究一直是稻瘟病菌研究的重点之一。目前对于附着胞诱导形成和穿透相关的信号传导机制已有较多研究，但对于稻瘟病菌附着胞的成熟机制还缺乏关注。本项目研究转录因子Vrf1在稻瘟病菌附着胞发育和致病过程中生物学功能，以及Vrf1等转录因子对下游附着胞细胞壁基因的调控网络及其机制，并着重解析下游基因在附着胞黑化过程中的功能。我们发现转录因子Vrf1专一调控附着胞成熟过程，尤其是附着胞细胞壁的黑化过程。Vrf1缺失突变体的芽管可以正常分化为附着胞，但细胞壁不正常，缺乏黑色素层，不能继续发育为一个具有正常形态和功能的附着胞。Vrf1突变体附着胞不能牢固地黏附在植物表面，其附着胞也不能侵入植物表皮细胞，从而失去致病力。实验结果显示Vrf1等转录因子协同调控附着胞成熟阶段而不是菌丝阶段的基因表达。在4-5 hpi附着胞中，Vrf1调控2701个下游基因的表达，其中1739个基因下调表达。在对300个下调基因的基因敲除研究中，获得了144个基因的敲除突变体。对其中15个基因突变体的表型分析发现这15个基因都参与附着胞的形成过程，是稻瘟病菌附着胞具有致病力必需的。下游基因11D9编码一个膜蛋白，参与附着胞细胞壁黑化、孢子物质向附着胞的迁移、附着胞内细胞器（线粒体、内质网等）的稳定、以及附着胞穿透过程。细胞壁和细胞膜是外界药物最先接触的真菌细胞结构，也一直是抗菌农药的重要靶点。理解稻瘟病菌附着胞细胞壁结构及其形成机制可以为我们提供更多、更优的药物作用靶点，可为设计新的抗瘟策略提供新思路。