金铁锁活性成分基因调控网络构建及其产物评价

Psammosilene tunicoides is one of the most important parts of the 'Yunnan Baiyao'. As local medicinal material and endangered plant, it mainly distributes in Yunnan. It also one special, the secondary conservation plants in China. We shall use the method of RACE, constructing cloning vector, BLAST analysis to obtain the cDNA of the P450 monooxidases from Psammosilene tunicoides; and use the method of infection of Agrobacterium rhizogenes carrying PP450 cDNA, Pβ-AS cDNA, PSS cDNA to get the stable generation within over-expression hairy roots with other P450 monooxidases gene, β-amyrin synthase gene, Squalene synthase gene. We study the active components relative to the formation of terpene precursors, the construction of terpene skeletons, the complex post-modifications to catch the key enzymes gene in the pathway; research the role of the methyl jasmonate and dramatically enhance the accumulation of triterpene saponin to exploit the mechanism of regulation. The products from different gene regulation will use for analgesia effect and anti-inflammation effect to evaluate and get their mechanism. The result will construct the foundation of the bioengineering and molecular biology in Psammosilene tunicoides; and offer a model of the establishing a network of the gene expression and regulation of active components and evaluating its product in plant pathways for endangered medicinal plant.

金铁锁是"云南白药"重要组成之一。为主产云南的我国特有国家二级保护植物，云南道地药材和濒危药用植物。本项目应用RACE、建立克隆载体、BLAST 分析等方法克隆金铁锁P450单氧酶cDNA；采用农杆菌介导法对金铁锁P450单氧酶cDNA和已得到的金铁锁鲨烯合酶、β- 香树素合酶cDNA进行转化；获得具有稳定遗传性状高表达外源P450单氧酶基因、β- 香树素合酶基因及鲨烯合酶基因的金铁锁发根系；研究金铁锁前体酶基因、结构酶基因和后修饰酶基因与活性成分三萜皂苷的相关性，分析金铁锁三萜皂苷的生物合成的关键步骤；研究茉莉酸甲酯MeJA诱导作用及合成途径相关酶基因超表达对金铁锁三萜类成分代谢流影响，探索其调控机制。同时评价不同的基因调控产物镇痛抗炎活性并阐明其机制。研究结果将为植物代谢途径生物工程在金铁锁应用奠定基础，为濒危药用植物生物合成途径关键酶基因调控网络构建及其产物研究提供范例。

金铁锁是“云南白药”重要组成之一。为主产云南的我国特有国家二级保护植物、云南道地药材。采用Illumina HiSeq 2500 高通量测序获得根和叶片转录组数据；基于BLAST 完成Unigene蛋白功能注释、KOG 功能注释、GO 分类和KEGG 代谢通路分析。获得短读序34.58 Gb， de novo 拼接注释得到 114115个Unigene。发现88个Unigene 与三萜碳环骨架及三萜皂苷合成相关；35个Unigene 与CYP450 相关，18个Unigene 与糖基转移酶相关。利用荧光定量PCR对其中7个关键酶基因进行了验证。克隆了三萜皂苷合成途径关键酶基因：β-香树素合酶（β-AS）基因、细胞色素P450 单氧酶、3-羟基-3-甲基戊二酸还原酶（HMGR）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鲨烯环氧酶（SE）、糖基转移酶（UGT）；构建了各基因相应原核表达体系及成功诱导蛋白表达，对所编码的蛋白进行了生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR检测不同组织部位的表达量。结果发现不同基因在根、茎、叶的表达量有差异，根部中表达量相对较高。对农杆菌介导后转化的金铁锁的毛状根进行外源诱导，分别使用MeJA，Ag+，NaCl进行外源刺激，检测其生物量、转录水平、次生代谢物积累量的变化，证明不同外源诱导下鲨烯合酶基因、β- 香树素合酶基因的表达与有效成分含量相关。构建了鲨烯合酶（SS）和β-香树素合酶（β-AS）植物表达载体，经农杆菌介导转化获得毛状根培养系。对β-AS序列进行扩增，利用酶切连接构建β-AS-pYES2异源表达载体，再转化至酿酒酵母感受态细胞进行异源表达鉴定表明该基因具有活性功能。采用醋酸诱导扭体、热板实验和二甲苯诱导小鼠耳肿胀实验，LPS诱导大鼠急性腹膜炎，HE染色观察大鼠腹膜组织病理变化，释放炎症因子（IL-6、IL-10）ELISA法，大鼠肠系膜组织免疫组化观察TNF-α、IL-1β、NF-κBp65表达，表明镇痛作用主要在外周，下调炎症因子的表达与NF-κB信号通道有关。项目基于转录组测序分析、基因克隆与表达分析、毛状根外源诱导转化和酵母工程菌构建等完成了金铁锁三萜皂苷前体酶、结构酶、后修饰酶基因网络构建及其调控研究，为后续金铁锁有效成分生物合成机理及其调控机制奠定基础。