基于“微流控PCR-纳米金磁微粒层析法”POCT分子诊断技术平台的构筑及临床试验研究

Point of Care Testing（POCT）is a common approach in the immunology chromatography, because of its advantages such as easy operation, low-cost manufacturing economy and rapid detection. It also has some limitations, while applying POCT technology to molecular diagnostic area, like high requirements on sample quality, complicated detection process and demand for large instruments. Based on the development of goldmag nanoparticles and micro-fluid chip in our prophase research, this work builds a novel POCT molecular diagnostic platform named “Micro-fluid PCR-lateral Flow Assay”, and studies the key technologies of this platform which involves multidisciplinary crossover; Through detecting single nucleotide polymorphism (SNP) MTHFR c.677C﹥T; c.1298A﹥C and MTRR c.66A﹥G, establish POCT molecular diagnostic platform model, carry out clinical trials and assess the advantages and feasibility of the technology platform as expected; Clarify the nano-materials in the system labeled biomolecule materialization mechanism. Dose-effect characteristics can be involved through the whole blood sample microfluid in the microfluidic chip cavity to complete the whole blood direct amplification. This study aims to provide a new approach, a novel and suitable genetic testing technology for individual diagnosis and treatment, and susceptibility gene screening detection technology for graded diagnosis and treatment.

即时检验（Point of Care Testing，POCT）多用于免疫层析技术，具有简单、经济、快速等优点，但将POCT技术用到分子诊断领域仍受到灵敏度不够、样本质量要求高、检测流程复杂及需大型检测设备等条件的限制。本项目基于纳米金磁微粒、微流控芯片的研究基础构筑“微流控PCR-纳米金磁微粒层析法”POCT分子诊断技术平台，研究该平台涉及多学科交叉的各项关键技术；以亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR c.677 C﹥T；c.1298 A﹥C）及蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR c.66 A﹥G）位点为检测目标，建立POCT分子诊断技术模型，开展临床试验研究，评估该技术预期的优势及适宜性；阐明纳米金磁微粒在本体系中增敏的物化机理及全血样本微流体基于微流控芯片实现全血直扩涉及的构效、量效特性。本研究的开展渴望为个体化诊治、易感基因筛查技术提供一个新选择，为分级诊疗提供一个适宜的基因检测新技术。

本项目围绕基于纳米金磁微粒及微流控芯片建立POCT分子诊断快速检测技术平台及临床试验研究，在项目实施过程中推进了三方面研究进展并取得了重要的结果。首先，结合微流控芯片技术平台，探讨了学科交叉、不同结构及界面的构效、量效特性，在其机理方面的基础研究为基于该领域分子诊断技术的开发提供一定的理论研究基础；另外，基于纳米金磁微粒研究建立了“LAMP-金磁微粒层析法”PCR扩增及检测技术，对该技术平台进行了性能评估及临床试验研究，该技术平台可以实现全血直接、DNA样本、口腔拭子多样本类型的扩增及检测，扩增无需专业的PCR设备，在25分钟左右即可完成检测，检测灵敏度可达到100 copies/mL，临床试验研究证明该技术具有很好的有效性及适用性，该技术的建立对后续不同级别检测机构及家庭自检奠定了基础，具有转化应用前景；最后，对于以亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR c.677 C﹥T ；c.1298 A﹥C）及蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR c.66 A﹥G ）位点为检测目标，开展了三个位点基于心脑血管发病风险及诊治相关性研究，研究表明，MTHFR A1298C及MTRR A66G基因多态性与Hcy水平升高并无相关性，而与脑卒中风险增加相关。MTHFR A1298C模型结果显示的CC型个体患脑卒中的风险为1298 AA/AC基因型个体的2.53倍。另外，与AA基因型相比，AC基因型与脑卒中的低风险相关，即AC型个体不易患脑卒中。MTRR A66G 模型结果显示，66 GG型个体患脑卒中的风险为66AA/AG基因型个体的5.45倍。这一结果对于MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多态性在心脑血管相关脑卒中疾病的预防及诊治提供一定的理论基础。