基于超低温冷冻电镜的蛋白酶体结构与功能研究

The proteasome is the most essential ATP-dependent intracellular protein-degradation nanomachine across the eukaryotic kingdom. About 90% of damaged or mis-folded proteins will be processed through the ubiquitin-proteasome pathway. However, the structural mechanism of substrate recognition and degradation by proteasome with the energy provide by ATP remains poorly understood. In addition, recent biochemistry study demonstrated that the proteasome also regulate histone H3K4 methylation through its crosstalk with CCR4-NOT complex, while the mechanism is unclear. By utilizing the emerging powerful electron cryomicroscopy (cryo-EM) technique, the research objectives include: To reveal the ATP-driven conformational changes of proteasome, and the mechanism of how these conformational changes are related to its substrate recognition, unfolding and degradation; To uncover the interaction mechanism of the 19S regulatory particle with CCR4-NOT complex, and their role in regulating histone methylation. The ultimate goal of this study is to uncover the mechanisms of proteasome-mediated degradation, and proteasome-regulated histone methylation, which could provide essential structure basis for the diagnosis and treatment of related human diseases.

蛋白酶体（proteasome）是真核细胞中极为重要的依赖于ATP的蛋白质降解机器。细胞中约90％受到损伤或错误折叠的蛋白质都会经由泛素（ubiquitin）－蛋白酶体途径降解。但是至今对蛋白酶体在ATP驱动下识别并降解底物的结构机制的了解仍十分有限。此外，蛋白酶体的19S调控颗粒还可以与mRNA加工复合物CCR4-NOT相互作用调节组蛋白H3K4的甲基化，但其机制仍不清楚。本项目拟主要应用新兴的超低温冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析蛋白酶体在ATP驱动下的构象变化，揭示该构象变化在蛋白酶体识别、去折叠、降解底物中的作用机制；阐明19S调控颗粒与CCR4-NOT 复合物相互作用的分子机制，为研究蛋白酶体在组蛋白甲基化中的调控功能提供结构基础。本项目有助于深入理解蛋白酶体调节下蛋白质降解的分子机制、及蛋白酶体对组蛋白甲基化的调节机制，将为探索相关疾病的诊治手段提供重要的结构基础。

泛素-蛋白酶体系统是真核细胞内最主要的蛋白质降解途径，细胞中约90％受到损伤或错误折叠的蛋白质经由该途径降解。蛋白酶体参与调控众多生物进程，其功能的异常与癌症、自身免疫病和神经退行性疾病等人类重大疾病密切相关，是重要的药物靶标。26S蛋白酶体是由至少33个不同亚基组成的超大分子机器， 其执行底物降解功能的过程与其在ATP驱动下的动态构象变化密切相关。但是由于激活状态下蛋白酶体高分辨率结构的缺失，至今对蛋白酶体在ATP驱动下被激活并执行底物降解功能的分子机制了解甚少。在本项目资助期间，主要研究进展如下：（1）首次解析了蛋白酶体在激活状态（结合ADP-AlFx）下的近原子分辨率冷冻电镜三维结构；（2）揭示了激活状态下的蛋白酶体呈现新构象，且与底物去折叠及转运密切相关的pore loop亦发生重排；（3）首次观测发现激活状态下的蛋白酶体结合核苷酸的不对称性，并且蛋白酶体核苷酸结合的对称性与其激活状态相关；（4）发现未结合核苷酸的ATPase亚基Rpt2和Rpt6的构象变化极为显著，预示其在底物降解过程中的重要作用；（5）阐释了蛋白酶体在核苷酸驱动下被激活，发生变构调节从而产生机械力以协助底物去折叠及降解的新机制。上述研究为深入理解其协助底物去折叠、转运及降解的分子机制提供了重要结构基础，为探索相关疾病的诊治手段提供了理论基础（Cell Res 2017）。.此外，我们还（1）揭示了分子伴侣素TRiC在结合ATP过程中按特定的时空顺序、分阶段进行的结构机制，实现了对TRiC开环状态的亚基精确定位，为深入阐释TRiC高度协同性及其特异性识别并折叠底物的机制提供了结构基础（Nat Struc Mol Biol 2016）；（2）阐释了抗肠道病毒71（EV71）单克隆抗体D5结合以及抑制病毒的结构基础，为基于D5抗体的抗EV71药物开发提供了新思路（PLoS Pathog 2016）；（3）揭示了跨膜蛋白LETM1可形成Ca2+/H+反向转运体以及其受pH调控的结构基础（Sci Rep 2016）。.其他合作研究包括：（1）揭示了从头甲基化转移酶DNMT3A自抑制以及组蛋白H3诱导DNMT3A激活的结构机制（Nature 2015）；（2）解析了人五羟色胺受体（5-HT3A）的结构，并对乙酰胆碱受体7进行了结构表征（Acta Pharmacol Sin 2015a，2015b）。