Hfq在RNA调控中行使功能的分子机制的结构生物学研究

The gene rpoS encodes sigma(S) subunit of RNA polymerase which is a global regulatory factor involved in many stress responses in Escherichia coli. It has been widely accepted that a variety of noncoding small RNAs (sRNAs) allow the precise regulation of rpoS mRNA translation by a multitude of environmental factors including oxidative stress, cell surface stress, and temperature change. Many sRNAs were reported to mediate the function of rpoS via basepairing-based interaction. The DsrA sRNA is a an 87-nucleotide, untranslated RNA that regulates expression of rpoS at low temperature. The DsrA secondary structure is conserved and is predicted to form a three-stem-loop structure. The first stem-loop is involved in the anti-antisense regulation of translation of the rpoS. On the other hand, RNA champeron protein Hfq was reported to play an indispensable role in this regulation. Escherichia coli Hfq consists of a conserved N-terminal Sm domain (amino acid residues 1～65) and a flexible C-terminal tail of 37 amino acid residues. Hfq interacts with regulatory sRNA and facilitates their antisense interaction with their targets. We are planning to employ multiple biophysical tools (NMR, EPR, and X-ray crystallization) to investigate the structure of Hfq complexed with RNAs, and the precise role of Hfq C-termius in the RNA regulation. The purpose of our research is to provide a better understanding of the structural and functional mechanism underlaying RNA regulation in Escherichia coli.

关于RNA调控目前被广泛接受的看法是：细菌对一些环境影响如氧化应激，渗透压休克，和温度变化的反应是通过一系列非编码的sRNAs来调节的。许多sRNA是通过直接的碱基配对和它们的目标mRNA来结合的，从而进一步影响mRNA的功能。DsrA是一个87个核苷酸的sRNA，它可以在低温下与rpoS基因发生相互作用，起到提高这个mRNA翻译水平的作用。rpoS编码RNA聚合酶的sigma亚基，因此被认为是大肠杆菌对应激响应的主调节者。具有RNA分子伴侣活性的Hfq蛋白被发现在DsrA 结合rpoS过程中对RNA相互作用起着重要的调节作用。我们计划使用综合X-ray晶体衍射、溶液核磁共振和顺磁共振等多种生物物理手段来研究Hfq及其RNA底物的多元复合物结构，以及Hfq的C末端在RNA调控中扮演的角色。通过这些结构研究，我们预期可以对Hfq在RNA调控中行使功能的结构基础和分子机制有个深入的了解。

在细菌中，Hfq介导的sRNA对mRNA翻译调控的网络广泛存在。一般认为，在Hfq的帮助下，sRNA可以和mRNA 5‘UTR上的某些序列通过并不完美的配对来实现对mRNA翻译的调控。虽然如此，在此过程中一些细节问题仍有待解决，比如Hfq是否需要同时结合sRNA和mRNA？Hfq六聚体圆盘侧面的RNA结合位点是否具有特异性？不同的sRNA利用Hfq调控mRNA表达的方式是否存在区别等。由于Hfq也广泛存在于致病菌里，并能够帮助细菌适应各种环境威胁，从而提高了细菌的生存能力从而改善了它的毒力和致病性。因此我们对Hfq体系功能机制的详细研究，将有助于我们在充分了解该机制的前提下，发展新的针对致病菌的药物和治疗策略。.在本项目执行过程中，我们通过一系列结构生物学研究，分别获得了大肠杆菌Hfq65蛋白和代表sRNA DrsA和mRNA rpoS的核酸序列的三元复合物晶体结构，并通过突变和功能数据说明了同时具备完整的两个RNA结合界面的Hfq蛋白才能有效的在体内介导DsrA对rpoS翻译调控，从而客观上证实了Hfq在细胞内需要同时结合sRNA和mRNA来实现功能调控。在另外一个研究中，我们获得了Hfq65与sRNA OxyS上A-rich序列的两个复合物晶体结构，通过与Hfq65-mRNA复合物晶体结构的比较，说明了OxyS通过与mRNA竞争结合Hfq蛋白来实现Hfq在细胞内的循环再利用的机制。我们得到的这些结果明确地解决了之前该生物系统存在的一些争议，为我们更好地理解Hfq在细菌应激系统中扮演的精确角色奠定了重要基础。