磁固定免疫探针涂层毛细管电泳技术及其在肿瘤标记蛋白质分离分析中的应用研究

Protein separation of capillary electrophoresis is great significant for the development of proteomics, and exploring the role of proteins in life science and disease diagnosis. However, how to avoid the problem of the proteins adsorption on the inner wall of the capillary, implement high efficiency, quantitative, fixed-point enrichment, and development suitable capillary electrophoresis method for the actual disease diagnosis of is still a challenging task. In the project, good biological compatibility magnetic nano gold materials were prepared, and then the stronger specificity, higher accuracy, and better magnetic responsiveness magnetic nano gold immune probes were designed to research the marker proteins of liver cancer. While, immune probe was immobilized in capillary inner wall by external magnetic field adsorption for magnetic materials, the coating is stable, compact and uniform. Using external magnetic field to control micro-channel magnetic particles or magnetic markers, and realize protein sample integration of enrichment, separation and detection by capillary electrophoresis coating magnetic nano gold immune probe coupling with laser-induced fluorescence detection. The implementation of the project will not only establish a new type of magnetic probe coating technology, and develop the magnetic separation methods in the application of capillary electrophoresis, but also provide a feasible research method for the separation of a variety of major disease related proteins.

蛋白质的毛细管电泳分离分析对于蛋白质组学的发展，探索蛋白质大分子化合物在生命科学和疾病诊断中的作用，具有重大意义。但是，如何避免蛋白质在毛细管内壁的吸附问题，实现蛋白质高效、定量、定点富集，发展适用于实际疾病诊断的蛋白质毛细管电泳分离分析方法仍然是具有挑战性的课题。本项目以肝癌疾病诊断中具有重要意义的标记蛋白为测定目标，拟制备生物兼容性佳的磁纳米金材料，设计特异性强、准确性高、磁响应性好的标记蛋白磁免疫探针。同时，采用外加磁场吸附磁性物质的方法，在毛细管内表面形成磁免疫探针涂层，通过对外磁装置参数设计，制备稳定、均匀，可控化的磁性涂层。再结合毛细管电泳激光诱导荧光对蛋白分离测定的优势，实现肝癌标记蛋白的富集、分离和检测一体化。本研究不仅建立了一种新型的外加磁场固定探针的涂层技术，发展了磁分离方法在毛细管电泳分析中的应用，并且为各种重大疾病相关的蛋白质的分离分析提供了一种切实可行的研究方法。

蛋白质分离测定在疾病早期诊断方面，尤其针对肿瘤、神经系统等疾病的研究已取得较大进展，是当今各个科学领域中极其活跃的学科方向。如何避免蛋白质在毛细管内壁的吸附问题，实现蛋白质高效、定量、定点富集，发展适用于实际疾病诊断的蛋白质毛细管电泳分离分析方法仍然是具有挑战性的课题。本项目系统开展了系列功能化特异性免疫涂层材料的制备，设计制备了多种磁性纳米复合功能材料，采用红外、电镜、核磁等不同表征手段证实材料被成功制备；通过外加磁场在毛细管内壁固定特异性免疫涂层的技术，完成了不同功能磁性复合材料毛细管开管柱的制备，通过优化外加磁场装置的大小、数量以及与毛细管之间距离等参数，有效增加涂层寿命，实现毛细管内壁上功能化免疫探针涂层的可控化，解决现有毛细管内壁涂层制备步骤繁杂及不能反复再生利用的关键科学问题。采用等电聚焦预分离法根据蛋白质具有等电点差异性和不同等电聚焦的特点，对蛋白质组分馏为一系列连续不同pH值的混合组分，按常规电泳分离方式进行二次分离，达到低丰度蛋白的检测限，并以肝癌蛋白标记物甲胎蛋白和血清铁蛋白为研究对象采用磁屏蔽脱附，毛细管电泳激光诱导荧光检测，实现富集、分离和检测一体化。通过免疫探针对甲胎蛋白、血清铁蛋白两种特异性蛋白定量、定点富集，增强分离效率，提高检测灵敏度，不仅克服蛋白质在毛细管内壁产生的吸附作用，解决蛋白质在传统纳米粒子表面上非特异性吸附的问题，而且通过血清等实际样品分析测定的结果表明该外磁场固定免疫探针毛细管电泳技术操作简单、成本低廉，适用于疾病早期诊断。本研究不仅建立了一种新型的外加磁场固定探针的涂层技术，并且发展了磁分离方法在毛细管电泳分析中的应用，为各种重大疾病相关的蛋白质的分离分析提供了一种切实可行的研究方法。