前扣带回皮层第五层锥体神经元参与神经病理性疼痛厌恶情绪形成的机制研究

The mechanism of neuropathic pain-related aversion remains unclear. Our previous studies found that in neuropathic pain, the excitability of layer 5 pyramidal neurons in the anterior cingulate cortex (ACC L5-PN) increased significantly. In addition, these neurons projected to the nucleus accumbens (NAc) and activated D2 type medium spiny neuron (D2-MSN). Inhibiting the projection from ACC to NAc alleviated the aversion of neuropathic pain animals. Therefore, we speculate that the activation of NAc D2-MSN by ACC L5-PN may be an important mechanism for the formation of aversion. In this project, we intend to further clarify the specific innervation of NAc D2-MSN by ACC L5-PN from the morphological point of view by using neurotracing combined with immunofluorescence. Next, by comparing the changes of pain threshold and conditioned place preference behavior, we will make clear the specific regulation of the ACC-NAc projection on aversion. Then, using photogenetics and electrophysiological methods, we can make clear the direct synaptic connection and receptor pathway between ACC L5-PN and NAc D2-MSN from the functional point of view. Finally, using photogenetics combined with chemogenetics, we intend to prove that NAc D2-MSN mediates the manipulation of ACC L5-PN on aversion, in vivo. The completion of this project is of great significance to elucidate the mechanism of neuropathic pain-evoked aversion.

神经病理性疼痛厌恶情绪的形成机制尚不明确，我们的前期研究发现，前扣带回皮层第五层锥体神经元（ACC L5-PN）投射至伏隔核（NAc）并激活D2型中型多棘神经元（D2-MSN），抑制ACC到NAc的投射末梢可减轻神经病理性疼痛动物的厌恶情绪。因此我们推测，ACC L5-PN激活NAc D2-MSN可能是厌恶情绪形成的重要机制。本项目拟采用神经示踪结合免疫荧光染色，从形态学角度明确ACC L5-PN特异性支配NAc D2-MSN；通过对比痛阈及条件位置偏爱行为的变化，明确该投射对厌恶情绪的特异性调控；采用光遗传结合电生理手段，从功能学角度明确ACC L5-PN与NAc D2-MSN的直接突触联系及其受体途径；使用光遗传与化学遗传相结合的方法，从在体层面明确NAc D2-MSN介导了ACC L5-PN对厌恶情绪的调控。本项目的完成对于深入阐明神经病理性疼痛厌恶情绪的形成机制具有重要意义。

神经病理性疼痛厌恶情绪对患者健康的影响巨大，但形成机制尚不明确。本项目首先进行了ACC到NAc神经投射的定性研究：将顺行示踪的化学遗传学病毒AAV-CaMKIIα-hM4Di-mCherry (AAV-hM4Di)注入ACC脑区，从而选择性地标记输出神经元，注射病毒4周后观察到NAc内侧壳区含有大量mCherry阳性纤维，提示ACC输出神经元将轴突投射到该区域。将逆行示踪剂，霍乱毒素亚单位B Alexa Fluor 594 (CTB-594)注入NAc内侧壳区，可以在ACC中观察到被红色荧光标记的神经元；进行全细胞膜片钳记录发现， CTB-594阳性ACC神经元的动作电位数目在CCI术后显著增加、其HCN电流幅度显著降低，这一现象被证实是ACC第5层锥体神经元过度兴奋的原因。.为了探究ACC到NAc的神经投射对神经病理性疼痛厌恶情绪的调控作用，本项目从抑制与激活两方面进行了实验，使用条件位置偏好(CPP)范式测试疼痛相关厌恶情绪程度：ACC注射AAV-hM4Di后4周，在NAc内侧壳区微量注射CNO时，AAV-hM4Di感染的CCI大鼠CPP评分显著高于对照组CCI大鼠，表明抑制ACC-NAc投射可能减轻了神经病理性疼痛的负面情绪体验，从而诱发条件性位置偏好。同时AAV-hM4Di感染的CCI大鼠与对照大鼠的痛阈值没有显著差异，表明ACC-NAc投射并不参与CCI诱导的痛觉超敏反应的形成。.进一步将兴奋性化学遗传学病毒AAV-hM3Dq注入ACC中，并通过在NAc中注入CNO激活ACC-NAc投射终端。结果显示hM3Dq+CNO处理组的假手术大鼠CPP评分显著低于对照组大鼠，提示激活ACC-NAc投射诱发了厌恶情绪。.本项目进一步探讨了ACC调控NAc的细胞分子机制：免疫荧光检测发现，ACC投射末梢与NAc的D1型中型多棘神经元（MSN）没有共标，与D2型MSNs有共标。进一步脑片膜片钳记录发现，在ACC内注射AAV-hM3Dq 后，NAc中被CNO激活的神经元是D2型MSN、而非D1型。进一步使用动物研究，在NAc预先注入D2受体激动剂从而抑制D2-MSNs的兴奋性，再将CNO注入到AAV-hM3Dq转染的假手术大鼠的NAc区，CPP试验结果显示D2受体激动剂显著减轻了hM3Dq+CNO诱发的厌恶情绪的程度。本项目的完成为建立神经病理性疼痛防治新策略提供了新思路。