卵巢癌相关抗原CT23全蛋白与抗原肽疫苗的抗瘤效应研究

In our previous studies, we had prepared the recombinant protein of ovarian cancer associated antigen CT23, screened the ovarian cancer cell SKOV3 in which CT23 was expreeesed, predicted CT23 epitopes by bioinformatics analysis, and found the high expression of CT23 in ovarian cancer tissues. For the application value of CT23 in auxiliary immunotherapy of ovarian cancer remains to be validated, this project will plan to do following subjects on the basis of our previous studies. To learn the antitumor effect of CT23 tumor vaccine, the specific CTL will be induced by sensitized DC, which is incubated with CT23 antigen peptide and CT23 recombination protein prepared, respectively. Experiments in vitro will help to detect the proliferation and cytokine secretion of the specific CTL and its killing effect on CT23 positive ovarian cancer cell. After inputting the specific CTL to bearing human ovarian cancer NOD-SCID mice model humanized immune reconstruction, in vivo experiments, antitumor effects such as mice survival time, tumor growth and angiogenesis will be anaylzed. After this project being completed, it would help to lay the foundation for the feasibility of CT23 as an attractive target in auxiliary immunotherapy of ovarian cancer.

本课题组在前期研究中已制备卵巢癌相关抗原CT23重组全蛋白，筛选出阳性表达的SKOV3卵巢癌细胞，经生物信息学分析预测了CT23的表位序列，并发现CT23在卵巢癌组织中高表达。CT23在卵巢癌辅助免疫疗中的应用价值有待验证，因此在前期研究基础上，本项目拟进一步做CT23肿瘤疫苗的抗瘤效应研究研究：用CT23抗原肽和课题组已制备的CT23重组全蛋白，分别致敏DC，诱导特异性CTL，体外实验检测特异性CTL的增殖和分泌细胞因子的情况，及其对CT23阳性卵巢癌细胞特异的杀伤作用；体内实验以荷人卵巢癌人源化免疫重建NOD-SCID小鼠为模型，输入特异性CTL后观察小鼠存活期、肿瘤生长与血管生成等抗瘤效应。本项目将为CT23用于卵巢癌辅助免疫治疗的可行性奠定实验基础。

卵巢癌是女性常见的恶性生殖肿瘤，具有发病隐匿、易复发与病死率高的特点。CT23限制性表达于正常组织、选择性高表达于包括卵巢癌的多种肿瘤组织，是肿瘤免疫治疗的潜在标靶。本项目研究内容包括：（1）通过表位预测软件进行表位肽的预测，选取高分值的肽序列；经生物公司合成、RP-HPLC 纯化和质谱验证后，通过结合 T2 细胞结合力、稳定性分析筛选出HLA-A*0201 限制性 CT23 抗原肽。（2）通过免疫组织化学与流式细胞术筛选出 CT23 与 HLA-A*0201 双阳性的卵巢癌细胞株。（3）用CT23蛋白或抗原肽分别致敏HLA-A*0201阳性志愿者DC，将已致敏 DC诱导T细胞转化为CTL，检测CTL的活力。（4）以卵巢癌细胞（CT23+，HLA-A*0201+）为靶细胞，同时设立对照组，通过 CCK8法、LDH 释放法和流式细胞术检测特异性 CTL对体外抗卵巢癌效应。（5）建立荷人卵巢癌 NOD-SCID 小鼠模型，输入 CTL 后观察特异性 CTL 体内抗瘤效应。本项目主要实验结果和意义：（1）筛选出了HLA-A*0201、CT23双阳性的卵巢癌细胞株OVCAR-3、HLA-A*0201阳性的志愿者；完成目的抗原HLA-A*0201限制性表位肽的合成、纯化与鉴定；以 CT23 全蛋白、抗原肽分别致敏HLA-A*0201的志愿者DC，诱导出特异性CTL。（2）通过CCK-8法及IFN-γ检测等实验检测各组CTL的免疫活力；通过LDH释放法和CFSE荧光染色法分析证实各组特异性CTL具有体外抗卵巢癌效应，并筛选出优势的HLA-A*0201限制性表位肽ALLVLCYSIV。（3）建立了荷人卵巢癌细胞OVCAR-3 NOD-SCID小鼠模型；各组小鼠尾静脉分别注射的CT23蛋白或CT23抗原肽ALLVLCYSIV诱导的特异性CTL、CT23无关抗原肽诱导的特异性CTL或PBS，证实CT23蛋白及ALLVLCYSIV诱导的特异性CTL均具有一定的体内抗癌效应。本项目证实了CT23全蛋及其抗原肽ALLVLCYSIV诱导的特异性CTL均具有一定的体内外抗卵巢癌效应，为今后制备出适合个体化治疗、更有效的抗人卵巢癌多肽疫苗提供理论依据与实验方案。