牡丹DGAT和PDAT选择性转移α-亚麻酸到油脂分子中的机理解析

Tree peony is a landscape plant with nutritional function since its seed is rich in α-linolenic acid. The selective transfer of α-linolenic acid on the glycerol backbone can affect the composition and accumulation of plant lipids, but the mechanism is not clear. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) and phospholipid:diacylglycerol acyltransferase (PDAT) are two rate-limiting enzymes that regulate the transfer of fatty acid to sn-3 position of triacylglycerol in plants. In previous studies, we found that sn-3 position of triacylglycerol was the main binding site of α-linolenic acid in tree peony seeds. This suggests that DGAT and PDAT may be involved in the efficient accumulation of α-linolenic acid in tree peony. Based on the cloning of DGAT1、DGAT2、PDAT1-1、PDAT1-2 and PDAT2 from tree peony, the DGAT or PDAT genes with a substrates preference for α-linolenic acid were identified via the restoration of TAG-deficient mutant yeast and enzyme activity detection in vitro based on [14C] labeled substrates. The role of the selected gene in α-linolenic acid accumulation was identified by transient expression in Nicotiana benthamiana leaves, virus-induced gene silencing system and Arabidopsis genetic transformation system. Furthermore, the transcription factors that interact with the selected gene would be identified via yeast one-hybrid system, electrophoretic mobility shift assay and dual-luciferase reporter system. Ultimately, the research results would reveal the molecular mechanism involved in efficient transfer of α-linolenic acid into triacylglycerol in tree peony seeds, and provide a theoretical support for high α-linolenic acid breeding of oil plants.

牡丹种子富含α-亚麻酸，是具有营养功能特性的园林植物。α-亚麻酸在甘油骨架上的选择性转移可影响植物油脂的成分和积累，其机理尚未解析。酰基转移酶DGAT和PDAT是植物油脂sn-3位脂肪酸转移的两个限速酶，申请人前期研究显示油脂sn-3位也是牡丹α-亚麻酸的主要结合位点，这表明DGAT和PDAT可能参与了牡丹α-亚麻酸的高效积累。本研究拟在牡丹DGAT1/2和PDAT1/2基因克隆的基础上，通过TAG缺陷型酵母的恢复实验和[14C]同位素标记的体外酶活实验鉴定出对α-亚麻酸有选择偏好性的DGAT或PDAT基因，再通过烟草瞬时转化、TRV-VIGS和拟南芥过表达体系验证目标基因在α-亚麻酸积累中的作用。进一步利用酵母单杂交、凝胶迁移实验和双荧光素酶报告系统选出与目标基因互作的转录因子，最终阐明牡丹种子α-亚麻酸高效转移到油脂中的分子模型，为油料植物高α-亚麻酸新品种选育提供理论支撑。

牡丹是我国传统名花，因种子富含α-亚麻酸而成为兼具营养功能特性的园林植物。然而截至目前，有关牡丹种子α-亚麻酸高效积累的分子机理尚未完全清楚。课题组通过脂质组学数据发现油脂sn-3位是牡丹α-亚麻酸的主要结合位点，该位点受到DGAT和PDAT两种酰基转移酶的调节，二者的酶活及生物学功能验证成为解析牡丹种子α-亚麻酸高效积累模型的关键。.为此，本项目主要研究内容包括：牡丹DGAT和PDAT的酶活性和脂肪酸偏好性鉴定；牡丹PrDGATs和PrPDATs基因的表达模式、亚细胞定位及启动子活性分析；牡丹PrDGATs和PrPDATs基因的生物学功能验证；目标基因上游转录因子的筛选及其调控功能分析。除此之外，我们对牡丹种子发育过程中脂质组学进行了深入研究。.获得的重要结果和关键数据包括：酵母突变体H1246的恢复实验检测了牡丹DGAT和PDAT的酶活，其中PrDGAT1、PrDGAT2和PrPDAT2对α-亚麻酸有选择性。通过烟草瞬时表达系统、牡丹TRV-VIGS系统、拟南芥稳定遗传转化系统验证表明PrDGAT1和PrPDAT2基因在紫斑牡丹种子高水平α-亚麻酸积累过程中发挥了重要的促进性作用。利用酵母单杂交、双荧光素酶报告系统选出与PrDGAT1启动子结合的转录因子PrGTE7，结合烟草瞬时转化系统证实 PrGTE7在α-亚麻酸积累中发挥作用。.综上所述，本项目通过对牡丹DGAT和PDAT的功能验证，最终探明了DGAT和PDAT选择性转移α-亚麻酸到油脂sn-3位点的作用原理及相关分子调控机制，实验结果对于完善植物α-亚麻酸积累的调控网络具有重要科学意义。PrGTE7及其靶基因DGAT1的功能解析，让我们对脂肪酸选择性转移的分子调控机制有了全新的认知。从而在生产实践上，为牡丹及其它油料植物脂质改良提供重要基因资源和模型参考。