水稻杂种花粉不育基因RHS12的图位克隆与功能分析

Strong heterosis existed between species and subspecies in rice (Oryza sativa L.), however, the widespread hybrid sterility seriously affected the utilization of heterosis. Hence, it has important theoretical value and practical significance to explore the hybrid sterility mechanism for application of heterosis. Our previously study identified a hybrid pollen sterile locus RHS12 which is common existence between specious and subspecies. Cytological observation indicated that the japonica type gamete in F1 pollen delayed development in the middle-uninuclear stage and resulted in pollen abortion. Furthermore, the RHS12 gene was narrowed in a 79-kb region on chromosome 12 by map-based cloning, and four open reading frames (ORFs) were predicted as RHS12 candidate genes by sequencing..In this study, the RHS12 will be cloned through functional complementary, over-expression, RNA interference and CRISPR experiments. Meanwhile, the biological function will be analyzed by expression profiling, in-situ hybridization, sub-cellular location, yeast two hybrid and co-immunoprecipitation. The completion of this project will not only provide new research ideas about rice reproductive isolation through making the RHS12 hybrid sterility mechanism clear, but also guide the heterosis utilization better by excavating the wild compatibility varieties carrying RHS12 affinity gene.

水稻种间、亚种间存在强大的杂种优势，但普遍存在的杂种不育严重影响了杂种优势的直接利用；因此，探索杂种不育机理对杂种优势利用具有重要的理论价值和实践意义。本研究之前鉴定了一个在种间、亚种间普遍存在的杂种花粉不育位点RHS12，细胞学观察发现该位点杂种F1花粉中的粳型配子在单核中期发育滞后，并最终导致败育。进一步利用次级分离群体将RHS12定位在第12染色体上79-kb的区间，通过测序将其中4个基因作为RHS12的候选基因。.本申请拟通过功能互补，过表达，干扰和CRISPR等实验验证RHS12位点的候选基因，克隆RHS12；同时利用表达谱分析，原位杂交，亚细胞定位，酵母双杂交和免疫共沉淀等实验明确RHS12的生物学功能。本项目的完成不仅能解析RHS12位点的杂种不育机理，为水稻生殖隔离提供新的研究思路；而且通过对携带RHS12亲和基因的广亲和品种的挖掘，能更好的指导杂种优势利用。

水稻有两个栽培种，亚洲栽培稻和非洲栽培稻，它们之间有强大的杂种优势。亚洲栽培稻高产、优质，而非洲栽培稻具有亚洲栽培稻所欠缺的抗病，耐逆等优良特性，因此利用两者的杂种优势对今后的水稻生产具有重要的意义。然而，两者之间存在严重的生殖隔离，其杂交F1存在多个杂种不育位点，因此鉴定并克隆其杂种不育位点对更好得利用其杂种优势具有重要的指导意义。本研究通过图位克隆将一个亚非栽培稻种间杂种不育RHS12位点定位在79-kb区间范围内，之后对候选基因进行了基因组测序和RT-PCR分析。通过转基因实验证明2790、2800和2810三个基因是RHS12目的基因的可能性最大。之后的酵母双杂交实验发现来源于DJY和NIL的2790基因与其它蛋白的互作有差异，暗示2790的蛋白差异是导致两亲本遗传功能差异的主要原因。最后，通过杂交发现Kasalath和Dular两品种携带RHS12的广亲和位点。综上，本研究的发现为最终克隆RHS12位点，在遗传和分子水平上解析RHS12导致杂种不育的原因奠定了坚实的基础，广亲和品种的发现也为在育种上打破RHS12位点产生的杂种不育提供了可能。