柠檬明串珠菌 D-/L-乳酸生成及其在传统泡菜发酵中的作用机制研究

As optical isomers, D-/L-lactic acids are produced by D-/L-lactate dehydrogenases from pyruvate. Because the human body does not have specific metabolic enzymes for the D-lactic acid, accumulation of D-lactic acid may cause acidosis and other metabolic disorders. Leuconostoc citreum is widely used in the food industries. It mainly produces D-lactic acid during the metabolic process. In the present research, in order to improve its safety as food starter, we will investigate the effective metabolic pathways of D-/L- lactic acids in the Leuconostoc citreum on the genetic level and identify important functional genes and regulatory sites by transcriptomic, proteomic and phylogenetic analyses. The characteristics of key enzymes will be studied via heterogenous expression within the Escherichia coli. After that we will change the activity of key enzymes using genetic engineering techniques including directional reconstruction and modification and clarify the regulatory effect of the key enzymes, coenzymes and metabolites of the lactate production pathways and minor metabolic pathways on the D-/L-lactic acid accumulation. Moreover, we will detect the changes of microbial diversities, key enzymes in lactic acid synthesis, D-/L-lactic acids and other metabolites during the fermentation process of pickles and explore the mechanism of Leuconostoc citreum acting on the generation of D-/L-lactic acids in pickles. The present study may provide a scientific theoretical basis for the targeted construction of the genetically engineered Leuconostoc citreum strain to make it become more suitable for being used as a food fermentation starter. This is a promoting innovation for the development of food industry.

光学异构体D-/L-乳酸，分别由D-/L-乳酸脱氢酶催化丙酮酸产生。因人体缺乏D-乳酸特异性代谢酶，D-乳酸堆积可导致酸中毒等代谢障碍。柠檬明串珠菌在食品领域应用广泛，但在代谢过程中主要生成D-乳酸。为提高其作为食品发酵剂的安全性，针对柠檬明串珠菌D-/L-乳酸生成途径进行基因水平的研究，通过转录组学、蛋白组学和系统发育分析，确定起重要作用的功能基因和调控位点；通过大肠杆菌中异源表达对酶特性进行分析，利用基因工程定向改造和修饰改变关键酶活性，综合分析乳酸生成途径和非主要代谢通路中关键酶、辅酶和代谢产物对D-/L-乳酸积累所起的调控作用；检测泡菜发酵过程中微生物菌相、乳酸合成关键酶、D-/L-乳酸及代谢产物的变化，研究柠檬明串珠菌对泡菜D-/L-乳酸生成的作用机制。本项目为针对性构建柠檬明串珠菌基因工程菌，使其更适合于发酵食品用发酵剂提供科学的理论基础, 这对食品工业发展是创新和推动。

柠檬明串珠菌是泡菜发酵初期主要优势菌群，改善发酵食品的风味、功能性和贮存期。柠檬明串珠菌只含D-乳酸脱氢酶，在发酵过程中生成D-乳酸。由于人体缺乏D-乳酸的特异性代谢酶，D-乳酸堆积可导致酸中毒，由此对人体造成的潜在危害应得以重视。. 因此，本研究首先分析了四川泡菜发酵过程中主要微生物对D-/L-乳酸生成的影响；通过柠檬明串珠菌糖代谢分析，确定D-乳酸生成相关的关键酶并进行特性分析；再通过L-乳酸脱氢酶的异源表达，改变柠檬明串珠菌中乳酸合成相关酶的活性，构建高产L-乳酸的柠檬明串珠菌，并将其作为食品发酵剂应用于四川泡菜发酵，综合分析四川泡菜D-/L-乳酸生成的影响。. 结果表明四川泡菜发酵过程中生成的D-乳酸与明串珠菌属、乳杆菌属等乳酸菌发酵有关。明串珠菌属发酵过程中生成的乳酸主要类型为D-乳酸并生成少量的L-乳酸，D-/L-乳酸比例约为4:1；随着发酵时间延长，D-和L-乳酸含量逐渐增加，到发酵20天的时候达到最高，而L-/D-乳酸比例在发酵12天时达到最高。. 确定了柠檬明串珠菌LCK_00389 （D-乳酸脱氢酶,ldhD）是生成D-乳酸的关键酶，并将ldhD基因进行了克隆、过表达和纯化。对酶特性分析的结果，D-乳酸脱氢酶的最适pH 为8.0，最适温度为30℃，1 mM Zn2+ 和SDS 显著抑制了酶的活性。. 将外源的ldhL 基因与丙酮酸激酶启动子连接后转化到柠檬明串珠菌，构建了高产L-乳酸的工程菌株，该菌株的L-LDH活性和L-乳酸的含量显著提高；将此改造菌株接种到四川泡菜后显著增加了L-乳酸的含量，显著降低了四川泡菜发酵过程中的D-/L-乳酸的比例。 . 通过本项目的研究，研究柠檬明串珠菌D-/L-乳酸生成相关的关键酶特性，利用基因工程有目的地改变柠檬明串珠菌中D-/L-乳酸的生成量及其比例，改良菌株特性，使其更适合于食品工业用发酵剂，为提高泡菜食用安全性提供科学的理论依据。