从黄芩苷对TLRs-NOD2模式识别及信号转导通路的调控探讨肺、脑相关炎性病变的共有机制

清热解毒药用于外源性感染为主的呼吸道疾病与内源性损伤为主的脑血管疾病的事实提示两种不同类型的病证中存在有一个共同的病理基础，对此进行研究，将有助于深入理解和发扬中医药的辨证施治理论，有助于深入认识清热解毒药的药效基础和作用特点。黄芩苷作为清热解毒药黄芩的有效成分对脑缺血再灌所致的脑损伤表现出了明确的保护作用。而这种保护作用的机制是否与其已有的抗炎作用有关，其作用的上游靶点在什么地方等，则是本课题所要探讨的核心所在。本课题以先天免疫模式识别受体TLR2,4和NOD2为主要研究点，探讨其相应的作用靶点及信号通路，进而与肺感染模型中相同的信号通路进行对比研究，以探讨黄芩苷的这种作用的共同机制。为深入认识清热解毒药的这种异病同治的应用提供重要的参考依据，并深化临床用药。

本项目按照任务书计划完成了相应的研究工作。进展顺利。取得了相应的结果。.黄芩苷是从中药黄芩主要活性化合物，具有显著的抗炎活性。黄芩及其黄芩苷作为一些中药复方注射剂的主要成分，在临床上既用于治疗内源性损伤为特点的脑中风，又常用于治疗外源性感染为特点的肺炎，提示脑中风和肺炎可能具有共同的病理基础。TLR2/4和NOD2属于先天免疫系统中的重要受体，与炎性反应密切相关。本研究为了探讨黄芩苷对先天免疫系统的影响，建立了脑神经元损伤模型和肺炎模型。其中前者包括细胞缺糖缺氧复灌模型和小鼠脑缺血再灌模型，后者包括细胞LPS/PGN激活模型和小鼠肺部LPS注射/金葡菌感染模型，从整体动物、细胞和分子水平共同研究黄芩苷对TLRs-NOD2受体及下游信号通路的调节作用，从而进一步探讨肺脑共同病变的基础。.体内、体外实验结果表明，脑中风模型中的TLR2/4、NOD2及下游TNFα表达均显著上调，提示神经元可以直接接受外界刺激并做出响应，激活了先天免疫系统中的模式识别受体进而介导炎性反应。肺炎模型中TLR2/4和NOD2表达量出现不同程度的上调，下游TNFα也做出了响应，提示这些受体参与了肺上皮细胞及小鼠肺组织中的炎症。黄芩苷则可以显著下调脑损伤和肺损伤模型中这些因子的异常表达，提示黄芩苷对先天免疫系统中的TLRs-NOD2受体及下游信号系统存在着调控作用，这种调控作用是肺脑病变作用的共同基础。.为了探讨黄芩苷与受体的作用方式，本研究进行了激活实验和RNA干扰实验，排除了黄芩苷直接作用于受体蛋白和直接作用于下游接头因子这两种可能，证明黄芩苷通过作用于受体上游的关键因子，从而调节了受体介导的炎性反应。在以上工作的基础上，我们又检测了黄芩苷的三种结构类似物对缺糖缺氧复灌处理的神经元细胞中TLR2/4、NOD2及TNFα表达的影响，进而比较它们对神经元的保护作用。为此类小分子的构效分析提供了实验依据。.进一步，本论文额外进行了以PC12细胞为研究对象，使用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）方法检测黄芩苷神经元跨膜转运的研究。结果表明，在24h时间内，100μg/mL黄芩苷给药30min后，细胞内黄芩苷浓度达到峰值，在8h后细胞内已没有黄芩苷成分。黄芩苷跨膜转运后，以其本身结构发挥神经系统保护作用。从而为研究阐释黄芩苷细胞内受体作用（NOD2）提供了实验依据。