禽多杀性巴氏杆菌粘附蛋白OmpH与其受体的相互作用及其致病机理研究

Our previous study demonstrated that the OmpH was an adhrerence factor of P. multocida type A strains,and identified the ATP synthase β subunit on CEF cell membrane was receptor for OmpH. In this study: 1)The encoding gene of ATP synthase β subunit will be cloned from the tatol RNA of CEF cells and human breast cancer MCF cell by gene cloning methods; 2)The recombinant ATP synthase β subunit (ATP5B) will be expressed using E.coli expression system of M15/pQE30, and the recombinant cATP5B and hATP5B will be purified with affinity chromatography, after that, the antibody against the cATP5B and hATP5B will be prepared by subcutaneous injection in rabbit; 3)The interaction between OmpH and ATP5B will be determined by Ligand blot, adhesion inhibition assay, scanning electron microscope; 4)Distribution of receptor of OmpH on surface of differrent host mucosal cells will be observed by Western blot，immunofluorescence microscopy and immunochemistry method；5）Toxicity of OmpH to CEF cells and cancer cells will be determined by MTT，CAM assay and nude mice as model. Research significance: 1)To clarify whether the β subunit of ATP synthase is a receptor for OmpH; 2)To discuss the distribution of ATP synthase β subunit on surface of different host mucosal cell and host specificity of avian Pasteurella mutocida; 3) Effect of OmpH to proliferation of CEF cells and tumor cells and to cancer angiogenesis will be determined.

本课题组前期研究结果表明OmpH是禽巴氏杆菌的粘附因子，初步鉴定CEF细胞表面的ATP合成酶β亚基是OmpH的受体。本项目研究内容包括：1.用基因克隆技术克隆CEF细胞和人肿瘤细胞的ATP合成酶β亚基基因；2.用原核表达系统M15/pQE30表达重组蛋白cATP5B和hATP5B，纯化及制备它们的抗体；3.用配体印迹、粘附试验和扫描电镜检测OmpH与ATP合成酶β亚基的相互作用；4.用蛋白印迹、免疫荧光法和免疫组化检测ATP合成酶β亚基在不同宿主粘膜细胞表面的分布；5.用MTT法、CAM试验和裸鼠模型确定OmpH对CEF细胞和肿瘤细胞增殖和血管生成的影响。 研究意义:1.确定ATP合成酶β亚基是不是OmpH的受体；2.探讨OmpH受体在不同宿主细胞表面的分布与本菌宿主特异性的关系；3.确定OmpH对CEF细胞和肿瘤细胞增殖的影响，为进一步研究OmpH在受体上的结合域及其致病机理奠定基础。

本课题组前期研究结果表明，外膜蛋白H是禽多杀性巴氏杆菌的黏附因子，它在该菌对宿主的感染与致病过程中发挥重要的作用，其受体可能是CEF细胞表面的ATP合成酶β亚基（ATP5B）。因此，本项目用RT-PCR分别从CEF细胞和人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA中扩增出ATP5B基因，将PCR产物克隆至原核表达载体，分别转化大肠杆菌BL21和M15，IPTG诱导表达重组ATP5B，亲和层析法纯化表达蛋白，用清洁级兔制备抗多克隆抗体，用配基印迹、ELISA和黏附试验检测OmpH与ATP5B的相互作用，用Western blot、ELISA和免疫荧光技术检测ATP5B在不同宿主细胞表面的分布情况，用MTT法、CAM试验和裸鼠模型检测OmpH抗肿瘤和血管抑制素活性。.主要研究结果包括：（1）CEF细胞和MCF-7细胞ATP5B基因长度分别为1401 bp和1620 bp，与已报道的野鸡和人ATP5B基因序列相似性分别为99%和100%；（2）用大肠杆菌表达系统BL21/pET-32a表达65 kDa的CEF细胞的N端带有Trx标签的融合蛋白ATP5B，用大肠杆菌表达系统M15/pQE-30表达61kDa的MCF-7细胞的N端带有6个组氨酸标签的融合蛋白ATP5B，它们均具有免疫原性；（3）重组ATP5B能够与OmpH结合，抗重组CEF细胞ATP5B抗体抑制禽巴氏杆菌C48-3株对CEF细胞的黏附，但抗重组MCF-7细胞ATP5B抗体的抑制作用不明显；（4）在CEF细胞和MCF-7细胞膜蛋白中检测到能够与OmpH结合的ATP5B，但在牛和猪黏膜细胞膜蛋白中检测不到ATP5B；（5）重组OmpH抑制CEF细胞、MCF-7细胞和肿瘤细胞SHG44的增殖以及鸡胚尿囊膜血管的生成。.本研究从分子水平上验证了OmpH受体是CEF细胞表面的ATP5B，它具有宿主特异性，还发现OmpH可能具有抗肿瘤活性和血管抑素活性，为进一步研究OmpH在受体上的结合域及其致病机理奠定基础。