SSAO抑制剂咖啡因抑制脂肪合成的分子机制研究

The research and development of SSAO inhibitors is a hot field since the activity of semicarbazide-sensitive amine oxidase was significantly higher in obese and diabetic patients. However, there are no natural, safe and effective inhibitors so far. Our preliminary results showed that caffeine can inhibit SSAO activity both in vitro and in vivo and significantly lower triglyceride levels in rats’ serum, but the molecular mechanism is not clear. We propose a new hypothesis that caffeine can inhibit SSAO activity, reduce glucose uptake in fat cells and ultimately block fat synthesis. To test this hypothesis, the project plans to carry out three aspects: The interaction between the caffeine and SSAO is investigated by mass spectrometry, computer molecular docking and SSAO enzyme activity assay; the absolute quantification assay (Concatamers of Q peptides, QconCAT coupled with multiple reaction monitoring ) is developed to quantify the key proteins in fat synthesis pathway; SSAO activity, SSAO abundance and caffeine content are investigated in the adipocytes at different time. The protein dynamics in fat synthesis pathway is explored by QconCAT assay to elucidate the molecular mechanisms of blocking fat synthesis by caffeine.

由于氨基脲敏感胺氧化酶在肥胖和糖尿病患者中活性显著升高，其抑制剂的开发一直是研究热点，不过，目前还缺乏天然、安全、有效的抑制剂。我们的前期研究结果表明，咖啡因在体外和体内可以抑制SSAO酶活性，并显著降低大鼠血清中甘油三酯的含量，但是其分子机制尚不清楚。本项目提出一个新假说，咖啡因通过抑制SSAO酶活，减少脂肪细胞对葡萄糖的摄取，最终抑制脂肪合成。为了检验该假说，拟开展三方面内容：①采用质谱法、计算机分子对接技术和酶活测定法系统研究咖啡因抑制SSAO酶的机理；②针对脂肪合成代谢途径上的关键蛋白质（群）设计QconCAT，发展定量肽段串联体蛋白质结合多反应监测的绝对定量方法；③建立细胞模型，探索不同时间小鼠脂肪细胞中SSAO活性、含量与咖啡因含量的规律，用QconCAT定量方法研究脂肪合成代谢途径上蛋白质绝对丰度的动态变化，阐明咖啡因抑制脂肪合成的分子机制。

氨基脲敏感的胺氧化酶（Semicarbazide sensitive amino oxidase，SSAO）是胺氧化酶的一种，具有催化伯胺氧化脱氨基的功能，同时还与内皮细胞介导免疫细胞黏附过程相关，因此也被命名为血管黏附蛋白（Vascular adhesion protein-1，VAP-1）。SSAO作为药物标靶越来越受到重视，但是目前对于其生理功能以及与肥胖相关的确切机制还不清楚。 咖啡因是常用的减肥药，我们发现其可以在体外和体内可以抑制SSAO酶活性，在过去对咖啡因减肥机理的报道中，主要集中在脂肪酸氧化的研究。本项目利用蛋白质组方法研究咖啡因对脂肪酸合成代谢蛋白通路的影响，首先，利用高脂饲料建立了大鼠肥胖模型，发现给药组大鼠脂肪组织及血浆中的SSAO酶活性受到显著抑制。其次，从Non-target及Target两方面研究咖啡因减肥机制。一方面采用差异蛋白质组学方法，共检测到64个差异蛋白，其中40个蛋白上调，24个蛋白下调，并用Westernblot对乙醛脱氢酶ALDH2蛋白进行了验证。另一方面，设计了并表达了由脂肪合成代谢通路特异性肽段串联而成的QconCAT（concatamers of Q peptides）蛋白，优化了质粒表达的条件、酶切条件，并检测了肽段18O标记效率。建立了液相色谱质谱多反应监测的定量方法，对脂肪合成代谢通路进行特异性定量,发现肥胖给药组β-氧化途径的β-羟脂酰辅酶A脱氢酶显著上调，与脂肪合成有关的β-酮酰合酶出现下调。这一实验结果验证了咖啡因对脂肪合成代谢通路影响机理的假设。最后，将高分辨非变性胶与免疫共沉淀（IP）结合建立了SSAO相互作用网络筛查方法；对大鼠脂肪细胞微粒体中的复合体组成方面进行了全景式筛查，并证明了SSAO与ALDH2的相互作用关系，对SSAO相互作用网络进行了全景全息式的分析，对于揭示其参与的生理过程和所发挥的生理功能提供重要的参考价值。