抗肝癌新靶点ASB3 E3泛素连接酶抗癌效应及分子机制研究

Ubiquitin-proteasome system, the largest multisubunit structure in cells, are critical for selectively degradation of various tumor-related proteins, in which E3 ubiquitin ligases are responsible for specifically recognition of substrate protein targets. The dysfunction and deregulation of the E3 ubiquitin ligases are reported to be closely related with oncogenesis and tumor development in various tumors; therefore, they are considered to be the novel molecular targets for cancer therapies. With high-throughput RNAi screening for 600 E3 ubiquitin ligases, we found that knockdown of ASB3, the substrate-recognition components of E3 ubiquitin ligases, dramatically suppress cell growth in Hepatocellular Carcinoma (HCC), also significantly induce apoptosis-like phenotype and typical LC3 autophagy-like punctate structures in the cells. These findings reveal that ASB3 plays an important role in controlling cell growth in HCC. In this proposal, we will further confirm the anti-tumor effect of ASB3 knockdown in vitro, and determine its underlying molecular mechanism especially by identifying ASB3 novel protein substrate; we will also examine the anti-tumor effect of ASB3 knockdown in animal model and primary cells from patients with HCC. Our study will understand the molecular mechanisms underlying ASB3 knockdown-induced suppression of tumor growth and provide direct and solid experimental evidence for ASB3 as molecular target to develop new drug against HCC.

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白选择性降解的重要途径，其中的E3泛素连接酶负责特异性识别大量靶蛋白，近年发现其功能失调与肿瘤发生发展密切相关，因此成为抗肿瘤药物研发热点。申请者通过目前国内外筛选RNAi文库最新的高内涵技术在肝癌细胞上针对600种E3泛素连接酶RNAi文库进行筛选，发现下调E3泛素连接酶底物识别蛋白ASB3可显著抑制肝癌细胞生长，形态学出现凋亡样改变，并诱导出典型的自噬表型，推测ASB3在肝癌生长中有重要作用，可能成为干预药物靶点。在此基础上，本课题拟全面阐明干预ASB3的抑制肝癌作用及其分子机制，重点鉴定ASB3的新底物，并在动物和临床标本上验证其临床应用价值。预期结果有助于深入理解 E3泛素连接酶作为新型抗肿瘤靶点的分子机制，为研发抗肝癌新药提供了依据。

本项目主要围绕阐明ASB3 E3 泛素连接酶与肝癌患者临床病理特征的关系，通过体内外实验验证下调ASB3 抑制肝癌细胞生长的分子机制及抗癌效应。我们紧紧围绕计划展开了相关实验，结果发现ASB3 蛋白在肝癌中较其癌旁组织呈显著上调，提示ASB3具有抗癌靶点特征；ASB3的表达量与患者血清中的AFP水平含量、肿瘤大小具有相关性，与患者的生存期及无复发生存期具有相关性，提示ASB3可能在促进肝癌的发生发展有重要意义。通过MTS和建立LM6裸鼠皮下荷瘤鼠模型等方法在体内外验证了下调ASB3能显著抑制肝癌细胞的生长。机制上我们首次证明死亡受体DR5作为潜在底物在下调ASB3诱导的线粒体凋亡途径中发挥重要作用，进一步证实下调ASB3既可以通过DR5泛素化也可以通过CHOP分别在蛋白和转录层面对DR5进行调控，从而发挥其抗癌效应。通过转染DR5L特异性的siRNA，阐明DR5L在下调ASB3诱导线粒体凋亡中的关键作用。最后我们证实了细胞内高水平的DR5对下调ASB3抑制细胞增殖是必须的，并进一步阐明下调ASB3可以显著增敏肝癌细胞对TRAIL的耐药！细胞自噬和凋亡相互交叉影响调控肿瘤增殖，我们发现下调ASB3不仅促进线粒体凋亡而且显著增强细胞自噬，机制上发现下调ASB3在蛋白层面上可以抑制Beclin1的表达，通过RNA干扰技术下调Beclin1可逆转下调ASB3诱导的细胞凋亡。深入研究发现下调ASB3诱发caspase8的激活进一步促进Beclin1的C端发生剪切最终诱导线粒体凋亡，提示下调ASB3可以通过激活caspase8和beclin1的剪切来激活细胞内死亡途径及放大细胞自噬效应，从而提出自噬激活剂与ASB3抑制剂的联合应用的潜在应用价值。此外为深入挖掘ASB3的潜在底物，我们利用高质量的蛋白质修饰类抗体和富集材料，巧妙的修饰肽段富集方法、先进的LC-MS/MS系统和高级生物信息学分析系统解析了ASB3的潜在底物的泛素化水平，结果一共检测到了2195个蛋白上的共5299个修饰位点，其中发现有248个蛋白泛素化水平显著增加，另外有381个蛋白泛素化水平显著降低。该部分数据结果有待于在后续工作中进一步证实和发现。综上这些实验数据充分肯定了ASB3在肝癌中的重要作用及应用价值。