马动脉炎病毒包装信号的鉴定及其在病毒复制中的作用

Viral encapsidation is a vital step for the viral replication and propagation. To the enveloped viruses, the packaging signal of virus genome is the first step and plays an important role to initiate a serial of events of viral encspsidation. With the development of molecular virology, the packaging signals of many viruses, such as influenza virus, Hepatitis B virus, HIV, coronavirus, have been identified, which were helpful for the study of the relevant virus. However, the packaging signal of equine artiritis virus (EAV), a representative member of arteriviruses, is still unknown. The reason for that is because of lacking efficient research system in the study of packaging of EAV. To analyze the packaging signal of EAV, we have constructed the infectious clone system of EAV. In this study, the packaging system of EAV based on deletion of nsp1 protein would be set up to resolve the packaging signal in the nsp1 gene of EAV. Then a pseudovirus would be constructed by inserting the potential packaging signal into the genome of a heterogenous virus, sindbis alphavirus, which would be used to analyze the packaging signal in the other potential regions. In order to identify the biological function of the packaging signal, the EAV replicon system would be adopted. The results of this study would be helpful for the development of packaging system of arterivirus in the future.

病毒的包装是病毒复制和增殖过程中的一个重要步骤，对于有囊膜的病毒来说，病毒基因组的包装信号是引发这一系列过程的起始和关键。随着分子病毒学的发展，许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒和冠状病毒的包装信号都已经被解析出来，这极大方便了对相关病毒的研究。然而，作为动脉炎病毒属的代表成员马动脉炎病毒（EAV），其包装信号仍然是一个悬而未决的问题，究其原因，EAV包装信号的研究一直缺乏有效的试验系统。为了研究EAV的包装信号问题，我们已经构建了EAV的感染性克隆。在此基础上，本课题将通过构建基于nsp1基因缺失的包装病毒来研究该区域潜在的包装信号，然后进一步通过将EAV所有潜在的包装信号区插入到另一种异源病毒基因组中（SFV甲病毒）构建成伪型病毒来研究EAV基因组其他区域的包装信号，并鉴定其潜在的生物学功能。本课题的研究将为我们开发利用动脉炎病毒包装系统提供科学依据。

包装信号是病毒蛋白识别自身基因组的重要信号，只有病毒基因组被包装到病毒粒子中，才能够形成完整的病毒粒子，完成新的生命周期。为了鉴定马动脉炎病毒（EAV）的包装信号，本申请课题在实验室已有的EAV感染性克隆的基础上，进一步建立和优化了鉴定包装信号的一系列检测方法。通过文献查阅和生物信息学分析，我们把EAV潜在的包装信号区域锁定到病毒基因组5’端、nsp1基因、nsp2基因、nsp11-nsp12基因和3’端。通过对这些区域采取连续同义突变的方式，突变掉所有潜在的包装信号序列，然后构建缺失包装信号的EAV感染性克隆，转染细胞，在细胞水平上检测病毒的基因组RNA、亚基因组mRNA、病毒N蛋白以及上清中的病毒基因组RNA和N蛋白含量。试验结果表明，同亲本病毒比较，同义突变掉nsp1基因、nsp2基因和nsp11-nsp12基因的感染性克隆在细胞水平上，病毒的基因组mRNA含量、亚基因组mRNA含量和病毒N蛋白含量均没有显著变化，释放到细胞上清中的病毒基因组RNA和N蛋白含量也没有显著变化。因此，我们可以得出结论EAV基因组的包装信号不在nsp1基因、nsp2基因和nsp11-nsp12基因区，EAV潜在的包装信号位于病毒基因组的5’端或3’端。进一步我们通过缺失突变病毒基因组5’端核苷酸序列发现，部分缺失病毒5UTR的感染性克隆并不能拯救出病毒，说明这些缺失区域除了含有潜在的病毒包装信号，还可能含有病毒的复制和转录调控序列。进一步，我们发现EAV基因组5’端233位点的同义突变会导致病毒拯救失败，通过验证，我们发现导致病毒拯救失败的原因是突变病毒亚基因组mRNA转录失败。因此，233位点含有病毒转录调控重要的识别序列。另外，我们还发现病毒基因组3’端12642位点的同义突变会导致病毒蚀斑大小发生变异，通过试验验证和生物信息学预测，我们发现该点的突变会导致EAV 3UTR区二级结构的改变，从而导致EAV复制受到影响。本研究丰富了我们对于马动脉炎病毒包装信号的研究，并且加深了对单股正链RNA病毒基因组复制和转录调控机制方面的研究，为今后研究该病毒的生命周期提供新的思路。