马氏珠母贝血细胞发生相关的核心结合因子（CBF）beta亚单元的时空表达模式研究及其上游调控因子的鉴定

血细胞是贝类的免疫细胞，在其免疫应答反应过程中发挥了重要作用，但对贝类血细胞的起源和发生过程知之甚少。一些转录因子在血细胞发生过程中发挥了重要的调控作用。我们通过对GenBank上马氏珠母贝(Pinctada martensii)EST序列的生物信息学分析，确定了一条编码与血细胞发生相关的核心结合因子（CBF）β亚单元的部分序列。本研究计划通过RACE技术获得马氏珠母贝CBFβcDNA的全长序列以及通过染色体步行技术获得其启动子区序列；通过原位杂交和免疫组化技术研究马氏珠母贝CBFβ的时空表达模式，期望对早期胚胎中的血细胞前体及血细胞进行精确定位；通过酵母单杂交和染色质免疫共沉淀技术确定调控CBFβ表达的上游基因。本课题的研究成果将为探讨贝类血细胞的起源和分化提供必要的分子工具，为进一步研究贝类免疫的细胞学机理提供基础信息，也将有助于进一步从演化的角度了解免疫性是如何起源、发生和演化的。

一、使用5’RACE、3’RACE等技术获得了马氏珠母贝PmCBFβ基因的cDNA 全长序列，并确定了PmCBFβ具有两种不同的选择性剪切方式。.二、获得了马氏珠母贝PmCBF β基因的基因组序列，确定马氏珠母贝PmCBF β有5个外显子、4内含子，确定PmCBFβ具有2个等位基因。通过genome walking技术，分离了PmCBFβ上游调控序列1.5kb。通过酵母单杂交实验，确定了PmCBFβ上游非翻译区能和人GATA-2转录因子发生结合。.三、制备了PmCBFβ重组蛋白及抗PmCBFβ抗体。分析了PmCBFβ蛋白在马氏珠母贝不同组织中的表达情况，确定了PmCBFβ蛋白在腮、消化腺和血细胞中表达水平较高。.四、制备原位杂交用的PmCBF β反义探针，进行mRNA原位杂交分析，实验结果显示各组织中无PmCBFβ表达的信号。出现这种结果，可能是因为PmCBFβmRNA在各组织中表达水平较低。.五、使用弧菌刺激马氏珠母贝，然后使用实时定量PCR分析了不同时相消化腺中PmCBFβ亚单元的相对含量。在刺激后3小时达到最高水平（P<0.01）,然后表达水平逐渐下降，在刺激后48小时达到正常水平。.六、为更好地探索贝类血细胞发生机制及贝类免疫的分子机理，本项目还对近江牡蛎血细胞发生相关基因进行了克隆和分析.1、分离了近江牡蛎的CBFα（HKCBFα）基因的cDNA全长序列和CBFβ(HKCBFβ)的部分cDNA序列。经序列分析，发现HKCBFβ与PmCBFβ一样，具有两种不同的选择性剪切方式（命名为HKCBFβ1和HKCBFβ2）。这表明，在贝类中，CBFβ具有进化上的高度保守性。通过实时定量PCR分析了HKCBFα和HKCBFβ在弧菌刺激后的表达模式。实验结果表明HKCBFα和HKCBFβ在弧菌刺激后，其表达水平均发生了显著变化。.2、利用RNA-seq的数据，对牡蛎基因在各个组织的表达进行了分析，以期望获得血淋巴细胞特异表达的基因。经过筛选，共获得了超过200个血淋巴特异表达的基因。使用实时定量PCR技术，对筛选到的血淋巴细胞特异表达基因已经在胚胎发育的各个时期进行了表达分析，结果显示大部分基因已经在囊胚期开始表达，说明了血淋巴细胞在胚胎发育早期已经开始了形成和分化。通过对其中15个基因的验证，确认AIF等5个基因主要在血淋巴细胞中表达。