S受体激酶SCR设别模体的确定与芸苔属SI全新测定方法的建立

国际前沿研究认为：花粉SCR首先解聚乳突细胞上的SRK-THL复合物，然后形成SRK-SCR复合物，进而启动芸苔属自交不亲和性信号传导过程。这明显意味着SRK-SCR 之间的相互作用程度与自交不亲和性强弱程度密切相关。我们在体外成功获得SRK-THL相互作用证据的基础上，拟首次创造性地利用巢式变异PCR，获得SRK的S结构域编码区的不同大小变异DNA区段，并与SCR的编码基因一起引入改良的新型酵母双杂交体系中表达,借助于测序和生物信息学分析以确定SRK识别并结合SCR 的模体，借助于阳性菌落统计分析以建立芸苔属自交不亲和性的全新测定方法。项目的成功，既可望发现蛋白质相互作用的新类型，又可望将原来自交不亲和性宏观繁琐的测定方法，首次转化为微型精美的菌落计数法。这对于倍受关注的芸苔属自交不亲和性（以及其他由蛋白质相互作用决定的宏观性状）的深入研究和利用，具有十分重要的理论和实际意义。

按照统计学要求，精心选取与Xi与Yi的相应甘蓝S等位基因系材料至少10种。在生物信息学分析的基础上，采用Clontech的MATCHMAKER Library Construction&Screening Kit及相关分子生物学技术，构建转录因子的AD-Yi表达载体，并将它们转化酵母，使其长成菌落。同时利用巢式变异PCR等技术，构建转录因子的BD-Xij表达载体，并将它转化酵母，使其长成菌落。. 将这些类型的菌落按照性别和统计学交叉组合，在设置对照和确定条件下，两两同时复印到同一个三重筛选板上，筛选出Xi与Yi相互作用的二倍体酵母细胞、以及Xij与Yi相互作用的二倍体酵母细胞。借助于生物信息学分析，确定了SRK识别结合SCR的模体为：HVⅡ+ HVⅢ 。借助于统计学分析，发现为自变量的菌落数（Y）与自交不亲和性强度(X)之间的数学关系为：Y=-11.929+60.387X, 这可能为芸苔属自交部亲和性测定的新方法。. 利用上述实验系统，扩充性地增加了一些相关研究内容。对甘蓝自交不亲和性信号传导元件ARC1-EXO70A1、THL-SRK和ARC1-SRK相互作用进行了检测,取得了较好的研究结果。此外，在以前克隆基因的基础上，对甘蓝自交不亲和性信号传导元件编码基因KAPP进行了克隆和序列分析。对SRK编码基因进行了甲基化分析。对EDFs荧光原位杂交技术进行了深入研究。. 项目已经发表论文20篇，还有几篇正在撰写之中。获得重庆市自然科学二等奖1项。培养硕士生6名，博士生2名，项目负责人被学校授予优秀博士导师称号。项目负责人已获得高级学者研究计划项目，到加州大学戴维斯分校访问半年，时间为2012-08-06到2013-02-05。 . 综上所述，我们超额圆满完成了预期的计划任务,并为今后得研究开辟了新的空间。