野生二粒小麦盐胁迫相关miRNA的鉴定及其调控机制研究

Wild emmer wheat (Triticum dicoccoides. L) is one of the most important genetic resource and gene bank for wheat genetic improvement. MiRNA, as a class of small non-coding RNA, plays the crucial role in response to diverse abiotic stresses in plants. Although it significance has been systematically studies in many plant species, litter is known about miRNA in wild emmer wheat (Triticum aestivum L.), especially those involved in the regulatory network of salt stress processes. This study intends to use high-throughput sequencing combined with bioinformatics analysis to investigate the differential expression profiles of miRNA in wild emmer wheat under salt stress, and then identifies the salt-responsive miRNA and their targets. Furthermore, the co- expression regulatory network is established based the expression level and miRNA-mRNA relationship and the hub miRNAs are obtained. Then, the spatial and temporal expression pattern, promoter and Cis regulatory elements, miRNA sequence polymorphism of the candidate hub miRNAs were systematically analyzed to understand the bio-genesis, expression and regulation of salt-related miRNAs. Finally, the biological function of the hub miRNAs was studied using VIGS and CRISPR/Cas9 methods. This study aimed to clarify the roles of miRNA playing in regulating the salt stress response in wild emmer wheat, which will provide the new view on the molecular mechanism of crop salt stress resistance and contribute to genetically manipulate small RNA to improve the salt tolerance of wheat and other cereal crops.

野生二粒小麦是小麦遗传改良最重要的种质资源和基因库之一。miRNA作为一类重要的非编码RNA，在植物逆境响应与抗性过程中发挥着重要作用。目前，有关野生二粒小麦miRNA的结构与功能尤其是盐胁迫相关miRNA的研究相对薄弱。本研究拟综合高通量测序和生物信息学方法，对其盐胁迫下miRNA表达谱进行分析，系统鉴定盐胁迫响应相关miRNA及其靶基因；然后，整合靶基因及前期已有转录组数据，建立起miRNA介导的调控网络，并发掘其中的中枢节点，得到盐胁迫响应关键候选miRNA；进一步，结合时空表达特性、启动子及顺式元件、miRNA序列多态性等分析，初步明确关键候选miRNA产生、表达及调控机制；最后，利用VIGS和CRISPR/Cas9技术对关键候选miRNA的生物学功能进行研究，以期阐明miRNA参与野生二粒小麦盐胁迫响应的调控机理，为利用小RNA改良小麦等作物的抗盐性提供有益信息。

野生二粒小麦是小麦遗传改良最重要的种质资源和基因库之一。miRNA作为一类重要的非编码RNA，在植物逆境响应与抗性过程中发挥着重要作用。目前，有关野生二粒小麦miRNA的结构与功能尤其是盐胁迫相关miRNA的研究还比较少。在本项目资助下，以野生二粒小麦耐盐品系B5和盐敏感品系A9为材料，首先利用小RNA测序技术对其在盐胁迫和正常培养条件下4个时间点的小RNA表达谱进行了系统分析，共鉴定到362个保守的和414个新的野生二粒小麦miRNA基因，丰富了麦类miRNA资源；通过比较耐盐品系和盐敏感品系miRNA表达谱差异，筛选鉴定到了97个盐胁迫响应相关miRNA，包括20个新发现的盐胁迫相关miRNA，为耐盐新关键miRNA的发掘鉴定了基础；在此基础上，基于生信预测和降解组测序，对盐胁迫响应miRNA的靶基因及其降解位点进行了预测和鉴定，在B5和A9品系分别鉴定到32508和27054个miRNA-mRNA关系对；进一步，基于前期获得的107份四倍体小麦的全基因组重测序数据及其耐盐性鉴定表型数据，提取、分析了所有盐胁迫响应相关miRNA及其靶基因的遗传变异信息，发现它们在四倍体进化过程中发生了明显的遗传瓶颈，但miRNA的瓶颈效应定于mRNA靶基因，并将这些变异位点与生物量等10个耐盐表型计算的耐盐指数（STI）进行关联分析发现，239个基因中的439个变异位点与耐盐指数显著相关，其中有10个变异位点是通过影响miRNA对靶基因的的结合效率，引起其表达变化而调控了耐盐表型性状，并挖掘了它们的优异等位变异；整合小RNA测序、RNA-seq测序、降解组测序和全基因组重测序等多组学数据，最终鉴定到了79个耐盐性关键miRNA-mRNA模块，并基于WGCNA构建获得了8个耐盐相关的miRNA-靶基因-共表达基因的遗传调控网络，且大部分候选miRNA处于调控网络的中心节点，功能主要富集于渗透调节、活性氧清除以及生长发育调控等，初步解析了其调控机制；最后，利用过表达对关键模块miR9674a-GSTU1和miR9772-ARF的生物学功能进行了初步分析，构建它们的STTM载体并转化了硬粒小麦和普通小麦，进一步的生物学功能和调控机制研究还在进行中。本研究为利用小RNA改良小麦等作物的抗盐性提供有益信息。