胚胎干细胞衍生的可兴奋细胞Ca2+穿梭运动耦联能量代谢及GSNO干预效应

内质网和线粒体间Ca2+穿梭运动是一种刚被揭示的亚细胞器相互作用生命现象，当受到刺激时，在线粒体外膜表面产生Ca2+热点频率增加。已知2型早老素可调节该穿梭运动过程，并具有病理学意义，提示存在Ca2+穿梭对细胞活动多重影响研究的新空间。本项目拟在前期已获胚胎干（ES）细胞分化可兴奋细胞内质网Ca2+平衡调控及PPARs表达特征基础上，进一步论证Ca2+穿梭运动与ES细胞定向分化可兴奋细胞的相关性，及与之相关能量代谢机制，初步阐明其在细胞分化与个体发育不可或缺的生命现象本质。拟采用ES细胞分化可兴奋细胞过程中Ca2+穿梭运动特征，探索生理及毒理浓度GSNO微环境对发育依赖性Ca2+穿梭运动和PPARs表达影响，导致耦联可兴奋细胞线粒体能量代谢变异。以此揭示Ca2+穿梭运动在细胞分化中的生物学意义，及外来因素调控Ca2+穿梭活动与疾病发生，胚胎发育及生命维系，衰老等重要生命过程的可能相关性。

项目实施期间严格按照资助项目计划书内容与分年度计划进行研究。基于内质网和线粒体由线粒体融合蛋白（mitofusin, Mfn）而并置（juxtaposition）形成特许通路，可促进两个亚细胞器间Ca2+穿梭运动的亚细胞器相互作用生命现象。本项目通过胚胎干（embryonic stem, ES）细胞定向分化为可兴奋细胞（心肌细胞、胰岛β细胞和神经元）过程，探索了生理情况下，内质网Ca2+经由三磷酸肌醇（IP3）受体和线粒体内膜选择性单输送体，激活三羧酸循环的3个限速酶而加速ATP产生。生成的ATP通过负反馈机制调控该通路IP3受体Ca2+释放而影响内质网Ca2+动力学，并提供内质网ATP泵回Ca2+予以贮存，由此形成Ca2+往返于两个亚细胞器间的穿梭运动耦联能量代谢。阐明了Ca2+穿梭运动特征与ES细胞定向分化可兴奋细胞的相关性，及导致偶联可兴奋细胞线粒体能量代谢，揭示了细胞分化中不可或缺的生命现象本质。1. 阐明了Ca2+穿梭运动特征形成对ES细胞定向分化心肌细胞的相关性。2. 阐明了ES细胞分化胰岛β细胞PPAR-β参与线粒体能量代谢特征，包括ES细胞衍生的胰岛β细胞线粒体功能与胰岛素分泌功能相关性；揭示了胰岛β细胞为可兴奋细胞，Ca2+穿梭偶联能量代谢决定胰岛素释放。3. 阐明了ES细胞分化神经元过程内质网与线粒体并置对ATP产生的影响，论证了ES细胞神经分化早期呈现能量代谢途径特征；明确了线粒体能量代谢与ES细胞分化为神经元的相关性；论证了PPAR-β对神经分化早期线粒体分裂融合蛋白的影响；明确了经PPAR-β-Mfn2-[Ca2+]M调控线粒体能量代谢促ES细胞神经分化。4. 论证GSNO导致“蛋白亚硝基化”修饰对心肌分化及内胚层形成影响，发现了GSNO可显著提高拟胚体内ROS含量及贴壁后搏动率，并显著提高贴壁3天后心肌特异性蛋白α-actinin表达。该作用与提高心肌前体细胞标志基因转录，与PI3K/p-Akt/通路激活呈正相关。分子机制研究揭示了GSNO使得过氧化物酶（Prds）被亚硝基化而灭活，底物H2O2适度积聚，有利于中胚层细胞向心肌细胞分化并进一步揭示了S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对促心肌分化及内胚层优先形成的调控作用，以此揭示GSNO在胚胎发育及生命维系，衰老等重要生命过程的。