杜仲调控草鱼胶原蛋白形成的机理及与肉质相关性研究

Studies showed that the collagen is highly concerned with the muscle quality, and the dietary Eucommia ulmoides Olive could increase the collagen level in muscle of fish. What kinds of active ingredients in Eucommia ulmoides Olive play the function and how they act on the synthesis of collagen? Few studies were conducted on the questions. Collagen type I is the main collagen in muscle, and the synthesis of collagen includes the expression of collagen gene (COLlAl and COLlA2), the hydroxylation and glycosylation of polypeptide chain, and the cross-linking formation of collagen fiber. Three key enzymes, prolyl hydroxylase (PHD), lysyl hydroxylase (LH) and lysyl oxidase (LOX) are involved in the synthesis of collagen. The present study will clone the full-length cDNA of the three key enzymes genes of grass carp firstly, then a series of cell cultures of skeletal muscle fibroblasts will be conducted with the active ingredients in Eucommia ulmoides Olive, including chlorogenic acid, aucubin, geniposidic acid, pinoresinol diglucoside, quercetin et al, to select the main factors that could significantly promote the synthesis of collagen, and these factors will be supplemented into diets to feed grass carp. The gene expressions of COLlAl, COLlA2, PHD, LH and LOX, the activities of key enzymes in the synthesis of collagen, and the flesh quality will be evaluated from the molecular level, cell level, bio-chemical level and histological level to explain the mechanism of Eucommia ulmoides Olive modulating the synthesis of collagen for improving the flesh quality of cultured fish.

研究表明，胶原蛋白与鱼类肉质密切相关，而杜仲能提高胶原蛋白含量，但杜仲的何种成分发挥了作用？是通过怎样的分子途径影响胶原蛋白形成？均无系统研究。肌肉组织以I型胶原蛋白为主，其形成包括3个环节: COLlAl、COLlA2 表达形成肽链，肽链羟基化和糖基化，胶原纤维交联化，其关键酶是脯氨酸羟化酶、赖氨酸羟化酶、赖氨酰氧化酶；本研究克隆草鱼胶原蛋白形成的3个关键酶基因，以不同杜仲活性成分(绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、槲皮素等)进行草鱼骨骼肌成纤维细胞的组织培养，筛选能显著促进胶原蛋白形成的活性成分，添加于饲料进行草鱼养殖试验，从分子、细胞，生化和组织学水平系统研究杜仲及其活性成分对草鱼COLlAl、COLlA2、脯氨酸羟化酶、赖氨酸羟化酶、赖氨酰氧化酶基因表达、胶原合成关键酶活性和肌肉品质的影响，初步阐明杜仲调控草鱼胶原蛋白形成的机理，为改善鱼类肉质提供依据。

杜仲对养殖鱼类的生长和胶原蛋白合成具有促进作用，但杜仲通过何种分子途径影响生长和胶原蛋白形成?在杜仲的众多活性成分中，主要是什么成分发挥了主要作用？针对这两个问题，本项目主要开展了以下研究：(1）克隆了草鱼胶原蛋白形成关键酶基因：脯氨酸羟化酶、赖氨酸羟化酶、赖氨酸氧化酶。(2）在细胞实验中，以杜仲（皮、叶）提取物和不同杜仲活性成分(绿原酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、槲皮素等)添加到肝细胞和肌内成纤维细胞培养液中，发现除松脂素二糖苷外，其他添加物均能显著提高肝细胞和肌内成纤维细胞增殖率，上调肝细胞中胰岛素样生长因子1（IGF-1）、蛋白激酶B（AKT）、雷帕霉素靶蛋白（TOR）等生长相关基因mRNA 表达，上调肌内成纤维细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅰ型胶原蛋白α1（COL1A1）、Ⅰ型胶原蛋白α2（COL1A2）、赖氨酸氧化酶（LOX） 和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）的基因表达，下调基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基因表达量。(3)在养殖试验中，在饲料中添加杜仲皮、叶和杜仲叶提取物及不同水平的杜仲活性成分饲养草鱼，发现杜仲皮、叶和杜仲叶提取物及绿原酸、芦丁、槲皮素、山奈酚可显著提高草鱼生长性能，改善草鱼肌肉品质，此外，京尼平苷酸、儿茶素、桃叶珊瑚苷也可在不同程度上改善草鱼肌肉品质。肌肉品质的改善主要是通过降低脂肪沉积和上调胶原合成相关基因、降低胶原分解相关基因的表达而提高肌肉胶原蛋白含量而实现的。杜仲及其活性成分可能主要通过mTOR、PPAR 和TGF-β/Smads/CTGF信号通路改善草鱼的生长、脂代谢和胶原代谢。绿原酸、槲皮素、芦丁和山奈酚是杜仲改善动物生长、调节脂代谢和促进胶原形成的主要活性成分。本次研究初步探明了杜仲及其活性成分调控草鱼生长和胶原蛋白形成的机制，并初步确定了发挥主要作用的杜仲活性成分，为养殖鱼类肉质的改善提供了重要依据。