基于蛋白质组学的日本血吸虫感染标志物-表位肽谱的筛选和鉴定

诊断是血吸虫病防治、考核疗效的关键。病原学诊断的敏感性太低，依从性差；抗体检测则不能区分现症和既往感染，无疗效考核价值，因此不能满足血防工作的需要。抗原检测除可诊断现症感染外，还可作为判断疗效的依据，但目前抗原检测研究但也鲜有突破性进展，无法用于实际工作。这主要是由于缺乏对血吸虫感染后不同时期的标志物及其消长规律的认识，使得以往的研究多基于偶然性和随意性，没有做到"有的放矢"。没有明确的感染标志物作为靶标已经成为免疫诊断技术进步的瓶颈。本项目拟用二维电泳技术建立血吸虫不同发育阶段的排泄-分泌蛋白质谱，并以不同感染量、不同感染时期和化疗后的血清筛选有关的感染标志物，并用亲和质谱分析鉴定这些标志物的抗原表位肽，并进一步验证。此具有诊断潜能的感染标志物-表位肽谱的建立将为更全面地研究血吸虫感染标志物的消长、转归及发展敏感性高、特异性好、适于个体诊断和流行病学评估的免疫诊断方法奠定理论基础。

血吸虫病是严重危害人类健康和影响社会经济发展的一种全球性疾病，大约有76个国家或地区流行血吸虫病，全球感染人数达2亿。 .血吸虫是具有复杂生活史的常见寄生虫，宿主体内的循环抗原是由活虫产生的，抗原检测除可诊断现症感染外，还可作为判断疗效的依据。本研究拟用二维电泳-质谱分析和免疫亲和的技术方法建立终宿主体内日本血吸虫主要发育阶段—成虫和虫卵的排泄-分泌物ESPs蛋白质谱，以期发现和筛选与诊断和/或免疫调节相关的感染标志物。.将成虫和虫卵ESPs进行二维电泳可得到重复性和稳定性较好的图谱。成虫ESPs得到166个蛋白斑点；虫卵ESPs得到138个蛋白斑点，差异表达的蛋白质斑点有40个，其中由成虫表达的有24个，虫卵表达有16个；共同表达的蛋白点12个。用感染后2周及6周兔血清进行免疫印迹反应，结果显示成虫ESPs中能被感染2周兔血清识别的蛋白斑点有6个，能被感染6周兔血清识别的蛋白斑点有4个；虫卵ESPs能被感染2周兔血清识别的蛋白斑点有4个，能被感染后6周兔血清识别的蛋白斑点有4个。挑取相对高丰度和/或差异反应蛋白点经过酶解后进行MALDI-TOF质谱鉴定，结果显示成虫ESPs中差异表达的相对高丰度蛋白中已知的蛋白有18种，与虫体的发育、能量代谢、合成代谢、基因表达的调控有关；另有假定蛋白7种。虫卵ESPs中相对高丰度的已知蛋白有2个结构域蛋白，一个转座酶，以及烯醇酶。成虫ESPs中能被感染后2和/或6周血清所识别的有裂解酶、氧化酶和一些未知蛋白。.进一步将成虫及虫卵ESPs与感染6周的兔IgG进行免疫亲和反应，随后进行串联质谱检测，成虫及虫卵ESPs共得到7个肽段序列，其中有3个相同肽段。ELISA检测显示，修饰后的合成肽段VMVDTLASMISPAGTDLKQER与感染2周及6周的小鼠血清有阳性反应，而不与吡喹酮治疗后10周的小鼠血清反应。 .本研究通过2-DE和免疫亲和质谱技术对日本血吸虫成虫、虫卵ESPs进行了研究，发现差异表达的蛋白质斑点40个。成虫ESPs多为参与虫体代谢和基因调控的组份；而虫卵则主要是结构域蛋白。在相对高丰度差异表达蛋白中，虫卵烯醇酶、成虫的肌球蛋白等功能清楚的蛋白以及几种假定蛋白可能具有早期诊断的价值。免疫亲和质谱发现了能与早期及急性期反应的肽段，下一步我们将对更多的感染相关蛋白和肽段进行研究。