具有微环境响应功能的可视化高效递送siRNA的类病毒载体

Gene therapy based on small interfering RNAs (siRNAs) has been considered as a promising anticancer approach. However, the major obstacle facing siRNA-based therapy is the absence of a series of safe and efficient vectors for the siRNA delivery. Although the viruses have been evolved to be natural masterpieces of gene delivery, the safety risks limit their further application. Compared to virus vectors, the non-viral vectors are safer, but their low in vivo delivery efficiency is not being satisfied. Therefore, applicant will use the solid phase peptide synthesis and fluorescence imaging technology to prepare siRNA carrier simulating virus with visualization and microenviroment response function. In this case, in vivo gene delivery process will be real-time tracked to optimize the structure of the carrier with similar viral delivery of gene function. Through the introduction of the active targeting and microenvironment-sensitive agents into the virus-like vectors, they not only have the virus-like components and morphologies, but also possess virus-like infections both in vitro and in vivo. Through the introduction of molecular group on the carrier with aggregation induced emission and two-photon fluorescence, the in vitro and in vivo gene delivery process can be real-time imaged. Based on the image information, the vector can be further optimized and upgraded to make it close to or beyond the ability of viral vector delivery. The development of this project will provide an important basis for the development of a new type of high efficiency and low side effect.

基于siRNA的基因治疗是一种很有希望治疗癌症的方法。但目前siRNA基因治疗缺乏安全、高效的载体。病毒载体可以高效递送基因，但存在潜在的安全隐患。非病毒载体更加安全，但其体内递送效率低。为此，申请人将利用多肽固相合成与荧光成像技术结合制备具有微环境响应功能的可视化递送siRNA的类病毒载体，实时跟踪载体体内外递送基因的过程，对载体结构不断优化使其具有类似病毒递送基因的功能，提升其体内递送效率。通过将具有主动靶向和微环境响应功能的基团引入载体，使其不仅具有类似病毒的结构和形貌，而且拥有同时在体内外类似病毒感染的方式。在载体上引入聚集诱导发光和双光子荧光分子，对其体内外递送基因的过程进行实时成像，为载体进行针对性的优化和升级，使其接近或超越病毒载体的递送能力。本项目的开展将为开发新型高效低副作用载体提供重要依据。

项目背景：.基因治疗已被认为是一种有望治愈先天性及恶性疾病的治疗手段。但目前递送载体不能完全满足基因治疗的需求。病毒载体具有较高的基因递送效率，但其潜在的免疫原性和致瘤性限制了其应用。非病毒载体如脂质体、聚阳离子等安全，但其体内基因递送效率低。因此，开发安全、高效的基因递送体系是基因治疗领域关键的问题。本项目针对基因递送过程中所面临的困难，设计了一系列多功能小分子载体，并对其在体外和体内的基因递送行为进行了系统研究。.研究内容： .首先，受病毒核衣壳结构的启发，设计了具有自指示功能的类病毒小分子基因载体TR4。该载体能与pDNA组装为具有类似病毒形貌的纳米纤维结构，不仅能高效压缩并保护pDNA不受核酸酶降解，而且在包括肿瘤细胞、正常细胞和胚胎干细胞等多种细胞的转染中都表现出了很高的转染效率。.进一步引入转铁蛋白（Tf），开发了一种兼具主动靶向和自指示功能的类病毒TR4@siRNA@Tf三元复合体系。TR4主要模拟病毒的核衣壳，能够赋予体系自指示以及压缩siRNA的功能；外层的Tf主要模拟病毒的囊膜蛋白，它的引入不仅降低了体系的细胞毒性，而且赋予体系主动靶向的功能。.最后，为实现小鼠肝部ApoB蛋白的沉默，构建了一种具有抗血清能力的氟化寡聚聚乙烯亚胺纳米组装体（fOEI NAs）用于siRNA的递送，并对其抗血清的机制进行了系统性研究。.重要结果及关键数据：TR4在转染人宫颈癌HeLa细胞时，其转染效率达70%；而作为聚阳离子载体金标准的PEI，其转染效率仅为15%。通过利用TR4的自指示功能，我们发现Tf的引入还能加快siRNA在细胞质中的释放。激光共聚焦显微镜结果显示，经过12 h的转染，TR4@Tf主要分布于细胞膜上且仍能很好的共定位；而细胞质内出现了游离的siRNA。主要是因为Tf能够与细胞膜上的转铁蛋白受体相结合，削弱了TR4@Tf与siRNA的结合，从而加快siRNA的释放。fOEI材料能够形成形貌类似脂质体的纳米组装体。实验结果表明，fOEI NAs在细胞水平具有高效的基因沉默效率以及优异的抗血清能力，而与其具有相似临界胶束浓度及表面电荷的烷基链修饰的OEI（aOEI-C12 NAs）却在血清的存在下基因沉默效率大幅下降。.科学意义：为设计制备具有自指示功能的类病毒小分子载体提供了新的方案，并为开发多功能类病毒载体提供了新的思路。