大肠杆菌基因工程菌发酵生产琥珀酸过程中CO2转运与固定的协同代谢调控

作为重要的绿色化工四碳平台化合物，琥珀酸被美国能源部列为12种最具潜力的大宗生物基化学品之首。CO2通过被动扩散进入细胞，再经固定反应被合成琥珀酸，因此CO2的转运与固定对琥珀酸的生物合成起决定性作用。本项目旨针对大肠杆菌基因工程菌开展CO2转运与固定协同代谢调控研究，平衡转运与固定过程，提高琥珀酸产量。首先，通过表达具有主动转运CO2功能的外源基因，使CO2由被动扩散变更为主动运输，扩大转运通量。然后，研究CO2固定反应中靶点基因正向调控方式，扩大固定代谢通量。最终，建立平衡而高效的CO2转运与固定协同代谢过程，实现CO2供求平衡，并阐明协同代谢调控机理。本项目首次使CO2由被动扩散变更为主动运输，扩大转运通量，为代谢途径间的协同调控提供新思路，对高产琥珀酸基因工程菌的构建具有重要的指导意义，并可利用琥珀酸生物合成过程耗CO2这一特性，减少大气中CO2的含量，缓解温室效应。

作为重要的绿色化工四碳平台化合物，琥珀酸被美国能源部列为 12 种最具潜力的大宗生物基化学品之首。CO2通过被动扩散进入细胞，再经固定反应被合成琥珀酸，因此CO2的转运与固定对琥珀酸的生物合成起决定性作用。课题组首先构建了CO2转运功能基因与CO2固定功能基因的基因库，确定了相关的靶点基因；其次，在大肠杆菌AFP111的细胞膜上成功的表达了蓝藻的HCO3-转运子SbtA和BicA，使大肠杆菌实现对HCO3-的主动运输，HCO3-转运通量比空白对照组提高了1.4倍，实现了CO2转运靶点基因的正向调控；然后，分别构建了具有CO2固定功能的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶编码基因pck的单独表达载体及共表达体系，最大限度的提高大肠杆菌固定 CO2的能力；最后构建了启动子文库，将4种不同强度的启动子与CO2转运和固定基因分别进行组装并组合表达，精细调控了基因表达并组合调节了CO2代谢途径，最终实现了协同表达体系的优化及代谢平衡，有效提升了目的产物合成效率，琥珀酸产量达到89.4 g/L，比出发菌株提高了37.5%。研究结果为产琥珀酸大肠杆菌的代谢调控提供了新思路，同时也为多途径的协同调控提供理论基础。