甘蓝型油菜叶绿体基因组特定区域高分辨率单倍型图谱的构建与分析

构建叶绿体基因组单倍型图谱具有重要的理论和应用价值，首先，叶绿体基因组具有非重组、高保守、多数母本遗传的特点，其次叶绿体基因组上有众多与光合作用、生物合成等相关的基因，绘制某一物种的单倍型图谱有助于全面、深入理解该物种种内进化和演化，特别对重要经济作物叶绿体基因功能的研究具有重大意义。但是在植物中，仅有少数模式植物构建了核基因组单倍型图谱，有关叶绿体基因组单倍型图谱的构建还尚为报道。我们将用于核基因组多态性的EcoTILLING技术成功用于叶绿体基因的分析中，在本项目中，拟以油菜为模式材料，利用高通量、快速的EcoTILLING技术构建叶绿体基因组特定区域的单倍型图谱，明确甘蓝型油菜资源中该区域的单倍型变异，阐明其分子进化规律，为优良叶绿体单倍型遗传资源的筛选与利用提供理论与技术方法，为进一步探究叶绿体基因的功能奠定基础，为植物叶绿体全基因组单倍型图谱的构建提供技术支撑。

构建叶绿体基因组（cpDNA）单倍型图谱具有重要的理论和应用价值，绘制某一物种的单倍型图谱有助于全面、深入理解该物种种内进化和演化，特别对重要经济作物叶绿体基因功能的研究具有重大意义，但是在植物中有关cpDNA单倍型图谱的构建还尚为报道。在本研究中我们以甘蓝型油菜为模式材料，构建了EcoTILLING技术成功用于cpDNA单倍型的分析，准确性达到100%，并进行优化，采取DNApooling的方法大大提高了检测效率，准确性达到85%以上，说明可以用该方法进行大规模的单倍型检测。检测结果显示，cpDNA目的区域共有五种单倍型，91.8%的材料属于一种单倍型，其它四种单倍型分别占4.3%、0.7%、2.0%和1.1%，且50%以上的变异是同义突变。我们重点研究了几个重要功能基因，发现rps16存在四种种单倍型，Hap-1占80.86%，说明其是该区域的主单倍型，另外三种单倍型各占16.80%，1.56%，0.78%；accD基因存在4种单倍型，rbcL基因存在4种单倍型，matK 基因有2种单倍型。atpB基因存在2种单倍型；atpB –rbcL间区存在6个单倍型，主要是碱基的缺失。分析上述结果发现cpDNA很保守，存在一种主要的单倍型和少数的稀有单倍型。鉴于此结果我们优化了cpDNA快速提取纯化的方法，通过混样高通量测序的方法，检测整个cpDNA的变异位点，再结合EcoTILLING技术确定混合样品的变异，检测每个样品的变异情况。测序结果同样显示90%以上甘蓝型油菜属于同一种单倍型。通过进化树分析，甘蓝型油菜cpDNA可能来源与其祖先种白菜型油菜，但是又有新的变异产生。本研究明确了甘蓝型油菜资源中特定区域的单倍型变异，为优良叶绿体单倍型遗传资源的筛选与利用提供理论与技术方法，为进一步探究叶绿体基因的功能奠定基础，为植物叶绿体全基因组单倍型图谱的构建提供了强有力的支撑。