双发射碳点/铜纳米簇比率荧光探针的制备及其对细胞内温度的测定

Temperature is one of the most important parameters that governs biological reactions within a live cell, dual-emitting ratiometric fluorescent nanoprobes as sensitive nanothermometers have showed great potential in living cells. However, there are several obstacles that need to be overcome before the practical use, such as the high toxicity of quantum dots, the photobleaching and low quantum yields of fluorescent dyes. Based on the success in sensing tenperature with copper nanoclusters (CuNCs), with fluorescent carbon dots (CDs), we propose to fabricate the core-shell CDs/CuNCs ratiometric fluorescent nanoprobes in this study. With the help of silane agents, the CDs are embeded in SiO2 spheres, and fuctionalized the surface of CDs/SiO2 with amination. After activated, the CuNCs are covalently linked to the amino functional CDs/SiO2. According to control the thickness of SiO2 layer, the performance of probes optimized. The variations of the two fluorescence intensity ratios display continuous color change upon exposure to different temperature, and thus obtain the visual detection. To evaluate the cytotoxicity, the relative viabilities of MC3T3-E1 and HeLa cells exposed to the dual-emitting nanoprobes will be measured by using the MTT assay method. The measurements over the physiological temperature range 25–45 ºC by using confocal fluorescence imaging method. This study will promote the fundamental research and future applications of dual-emitting ratiometric fluorescent nanoprobe.

细胞内温度的细微差异能指示生物体新陈代谢活动的状态，而双发射比率荧光探针作为一种可靠性强的荧光温度计在活体细胞中显示了巨大的应用前景。然而，其实用性面临许多挑战，如量子点材料的细胞毒性较高、生物相容性差，而荧光染料易发生光漂白、量子产率比较低、多发射信号输出难。基于铜纳米簇可成功应用于细胞内温度检测，结合荧光碳点，本课题组拟制备具有核壳结构的双发射比率荧光探针。采用硅烷化试剂修饰的方式，将碳点包埋在硅核内，而作为响应荧光信号源的铜簇通过共价键合连接到硅层表面。通过控制硅层的厚度，调控两种荧光材料间的距离，优化比率荧光探针的性能；研究探针在体外的温敏特性，利用双发射比率探针强度比值的变化输出光学信号，并导致荧光颜色发生改变，实现对温度的可视化检测；考察探针细胞内的生物相容性和毒性，以探针的荧光性质来反映细胞微环境温度变化。研究成果将为新型双发射比率荧光温度计的研制和应用奠定基础。

细胞内温度的细微差异能指示生物体新陈代谢活动的状态，因此，对细胞内温度进行实时、精确而无损伤的测定已成为生物医学诊断和治疗过程中重要的研究手段。近年来，研究者借助荧光探针材料对温度的敏感特性构筑荧光响应纳米温度探针，从而满足细胞内温度测定的实际需求。在已报道的荧光探针中，多数都是以单一荧光单元的增强或减弱作为响应信号，而这种基于单一荧光强度变化的探针易受检测底物、测试条件、探针浓度、环境pH值等因素的干扰，所以测量荧光探针的绝对强度意义不大。在实际应用中，通常采用具有双发射比率荧光探针，根据两个良好分辨率的波长下荧光强度的比值随温度的变化实现对温度的测量，其信号变化有很好的视觉效果，更容易被裸眼观察。此法为环境中除待测物外的其他因素所造成的干扰提供内校正，消除了激发光源的强度漂移所造成的信号变化。更重要的是，由于碳点具有发射可调性，该探针能产生比率荧光检测所得的信号与自身的浓度无关，极大地提高了定量测定的精确性。. 基于此，本项目制备了双发射比率荧光碳点。采用静电作用力将蓝光发射碳点和橙光发射碳点相结合，自组装成稳定的CDs/CDs双发射探针。蓝光碳点的荧光对温度的变化不敏感，作为参比物质，提供可靠地参比信号；而橙光碳点具有良好的温敏性，则作为相应荧光信号源。通过控制蓝光碳点和橙光碳点的比例，优化比率荧光探针的性能，最终得到最优的CDs/CDs探针探测范围达到15-85C，涵盖了生理温度范围；灵敏度较高，达到0.93％/C，且具有可逆性和重现性。研究探针在体外的温敏特性，利用双发射比率探针强度比值的变化输出光学信号，并导致荧光颜色发生改变，实现对温度的可视化检测；考察探针细胞内的生物相容性和毒性，以探针的荧光性质来反映细胞微环境温度变化。研究成果将为新型双发射比率荧光温度计的研制和应用奠定基础。