茭白黑粉菌菌丝形态发生相关基因的克隆及功能分析

茭白是我国第二大水生蔬菜，其内生真菌-茭白黑粉菌的菌丝形态是决定茭白茎部膨大、保证茭白商品性的关键。但迄今为止，茭白黑粉菌菌丝形态发生的相关基因和分子机制仍不清楚。本课题组首次分离得到菌丝形态茭白黑粉菌，并通过与酵母形态茭白黑粉菌的双向电泳图谱比较和质谱分析发现与菌丝形态发生相关的MAP激酶激酶在两种形态黑粉菌间差异表达。本项目拟以菌丝型和酵母型茭白黑粉菌为实验材料，构建抑制消减杂交文库，克隆茭白黑粉菌MAPK途径相关基因。通过荧光定量PCR、生物分子相互作用分析技术和遗传转化技术，研究茭白黑粉菌MAPK途径相关基因的表达模式、MAPK途径各相关蛋白间的相互作用及该途径上游信号分子和下游应答因子，并通过转基因进行功能验证，以明确茭白黑粉菌MAPK途径相关基因的功能，分析茭白黑粉菌菌丝形态发生的分子机制，为进一步探讨茭白的孕茭机理和灰茭形成机制奠定基础。

茭白是我国第二大水生蔬菜，其内生真菌-茭白黑粉菌的菌丝形态是决定茭白茎部膨大、保证茭白商品学的关键。但迄今为止，茭白黑粉菌菌丝形态发生的相关基因和分子机制仍不清楚。本课题组首次分离得到菌丝形态茭白黑粉菌，进行了菌丝型茭白黑粉菌的基因组测序和菌丝型、酵母型黑粉菌不同发育时期的表达谱分析，通过分析发现与菌丝形态发生相关的MAPK途径关键基因UeERK、UeMKK、UeSSK及PKA途径关键基因UePKA在两种形态黑粉菌间差异表达。课题组围绕茭白黑粉菌菌丝形态发生相关的可能机制，展开了以下几方面的工作：1、完成茭白黑粉菌的分离和培养，进行了影响茭白黑粉菌菌丝形态发生的培养条件分析。结果表明，萨氏培养基、28℃利于茭白黑粉菌菌丝形态的发生，以乳糖、半乳糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖为唯一碳源的培养基可诱导酵母型黑粉菌向菌丝型转换，而在麦芽糖为唯一碳源的培养基上茭白黑粉菌无法形成菌丝。2、克隆了UeERK、UeMKK、UeSSK及UePKA的基因全长，长度分别为1828、2204、7148、1949bp，经Blast比对，与相应基因的相似度在78%-90%之间，各基因均具有丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化域、蛋白激酶ATP结合位点、丝/苏氨酸蛋白激酶活化位点。UeERK、UeMKK、UeSSK分属于MAPK途径的MAPKKK、MAPKK和MAPK。3、完成了四个基因的荧光定量PCR条件优化，在分别以麦芽糖、蔗糖为唯一碳源的培养基中培养4、8、12、16天的定量PCR分析结果表明，各基因的表达量差异表现出较为一致的趋势，且在蔗糖为唯一碳源的培养基上培养四天时出现最大表达量。4、完成了各基因的原核表达及互作分析。结果显示各基因之间不存在显著的互作关系。5、构建了遗传转化体系，基因敲除菌株的形态观察发现，UePKA、UeERK和UeMKK敲除的菌株在诱导培养基上无法形成菌丝，而UeSSK能够形成菌丝，但形成速度要慢于野生型。项目共发表和录用论文9篇，其中SCI论文2篇（累计影响因子13.255），一级期刊论文4篇，授权发明专利1项，研究成果获得浙江省高等学校科研成果奖二等奖（2012）1项。