肠杆菌FML-C1厌氧发酵产氢的代谢途径迁移

基于目前采用单菌纯培养厌氧发酵制氢的基质转化率低和产氢速率不高的问题，利用本课题组前期筛选的肠杆菌FML-C1厌氧发酵产氢，通过检测底物消耗速率、细胞生长速率和乙酸、丁酸、乙醇、氢气、二氧化碳等各代谢终产物的生成速率，进行代谢途径通量分布分析（MFA），采用2D电泳检测各代谢途径中关键酶的酶量变化，同时采用"特异性酶促反应法"测定各关键酶的酶活变化，确定代谢网络中影响氢气转化的柔性节点和关键酶，分析产氢代谢的差异是源于酶活性的改变还是酶量的改变，揭示肠杆菌厌氧发酵产氢代谢途径迁移的机制以及途径迁移与氢气转化的偶联关系。本研究的重要创新在于从"酶水平"分析厌氧发酵产氢代谢途径迁移的机制，补充和完善现有厌氧发酵产氢的理论体系，为厌氧发酵产氢的代谢工程研究和菌种的基因工程改造提供理论依据，为高效厌氧产氢菌种的构建、育种和产氢的定向代谢调控奠定基础。

基于目前采用单菌纯培养厌氧发酵制氢的基质转化率低和产氢速率不高的问题，本项目主要利用前期筛选的肠杆菌FML-C1厌氧发酵产氢，考察pH、缓冲体系、氧化还原电位对细胞生长、底物消耗及产氢量的影响，并根据发酵产氢过程中所测的气相代谢产物和液相代谢产物建立代谢网络图，分析ES3的发酵类型，同时采用2D电泳和“特异性酶促反应法”检测各代谢途径中关键酶的酶量和酶活变化，确定代谢网络中影响氢气转化的关键酶。结果表明：1）ES3的最佳产氢pH值为5.8，在该pH条件下，添加适量的缓冲体系后，ES3的产氢效果更佳；同时当L-半胱氨酸浓度为300 ml/L时，ES3的产氢量最大，其氢气转化率可达到1.29 mol H2/mol Glu。2）ES3在厌氧发酵过程中的主要代谢副产物为乙醇、乙酸、2, 3-丁二醇、少量琥珀酸和乳酸，发酵类型属于混合酸和丁二醇发酵。3）氢化酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶属于代谢网络中影响代谢通量分布的关键酶，酶活导致代谢途径的迁移。因此可以通过酶活的提高来提高系统的产氢能力和产氢速率，从而为高效厌氧产氢菌种的构建、育种和产氢的定向代谢调控奠定基础。