miRNAs调控大鼠Leydig细胞增殖及雄激素合成的机制研究

Leydig cells, which have exclusive function of synthesizing and secreting androgens, are considered as the major source of androgen in mature males. It is well known that androgens regulate the development and function of the male reproductive tract and spermatogenesis as well as metabolism. The decrease of Leydig cell number or androgen synthesis leads to androgen deficiency and then affects the physiological functions of muscle, skeleton, angiocarpy and testis. Although numerous studies have focused on physiological functions and development of Leydig cells, the miRNA-mediated regulation of Leydig cell proliferation and steroidogenesis has not been investigated. We'll identify the miRNAs that regulates the proliferation and steroidogenesis using the technology of overexpressing or silencing some selected miRNAs in the Leydig cell lineage.The differential expression of target mRNAs or proteins will be analyzed subsequently using immunoprecipitation, transcriptomics as well as iTRAQ proteomics.Combined with the analysis of bioinformatics, the miRNAs-mediated regulatory mechanism will be demonstrated after performing experiments in vitro and in vivo. This project will provide with the implications for understanding the proliferation and differentiation of Leydig cells and developing new therapy for androgen deficiency.

睾丸leydig细胞（leydig Cell，LC）是一种具合成和分泌雄激素功能的细胞，其数量减少或激素合成通路受损都会导致雄性体内雄激素缺乏，进而引起骨骼、肌肉、心血管及生殖系统发生病理生理学的改变。尽管在LC生长发育过程及生理功能方面已有研究，但对其分化过程中miRNA的调控机制至今尚未明确。本项目以大鼠leydig细胞为研究对象,在前期miRNA芯片筛选的基础上，利用过表达或沉默表达的方法，鉴定不同发育阶段LC中特异性表达调控LC增殖和雄激素合成的miRNAs及其时序性变化。然后，通过免疫共沉淀、mRNA表达谱芯片、iTRAQ定量蛋白组学及生物信息学方法构建调控增殖及激素合成信号通路中miRNA/mRNA网络的组成和检测关键蛋白表达的变化。最后，结合细胞和动物实验验证，阐明miRNAs对LC增殖和激素合成过程的调控机制。本研究将为今后治疗男性雄激素缺乏疾病提供新的理论依据和治疗靶点。

睾丸间质细胞（LC）是一种具合成和分泌雄激素功能的细胞，其数量减少或激素合成通路受损都会影响雄性体内雄激素合成。成体LC发育经历干细胞（SLC）、祖细胞（PLC）、未成熟细胞（ILC）和成熟细胞（ALC）四个阶段。. 对PLC、ILC和ALC中677种miRNAs表达谱分析结果表明，68种miRNAs在LC不同发育阶段中的表达量有2倍以上差异。随后，这些miRNAs被转染到LC中，利用RIA检测其雄激素合成情况。结果显示，在PLC中，有23种miRNAs显著抑制或者促进雄酮的合成；在ILC中，有16种miRNAs显著抑制3α-DIOL的合成；而在ALC中，9种miRNAs能显著抑制睾酮的合成。比较上述结果，6种miRNAs（miR-299a-5p、17-5p、29a-3p、29b-3p、7a-5p和199a-5p）能同时抑制不同阶段LC雄激素合成。其中，miR-299a-5p抑制PLC、ILC和ALC雄激素合成的能力分别为对照组的8.58、5.42和10.8倍。.为了解miR-299a-5p的调控机制，我们对PLC转染miR-299a-5p inhibitor并检测StAR、CYP11A1及HSD3B1的表达情况。结果显示，抑制miR-299a-5p的表达可显著促进Star（10.42倍）和cyp11a1（13.5倍）mRNA的表达，但抑制hsd3b1（7.25倍）的表达。蛋白杂交结果表明，StAR和HSD3B1的表达趋势与其基因表达的一致，但CYP11A1则相反。这些结果提示，miR-299a-5p可能通过介导LC激素合成通路关键酶的表达来调控雄激素合成。生物信息学分析提示，miR-299a-5p是通过转录因子网络调控激素合成酶的表达。动物实验结果表明，睾丸内注射5nM miR-299a-5p inhibitor能显著影响大鼠体内睾酮的合成和分泌。此外，miR-299a-5p还能引起PLC异常增生，破坏曲细精管结构及睾丸萎缩。综上所述，miR-299a-5p是调控LC发育及雄激素合成的关键分子，其调控机制将为今后治疗男性生殖系统发育及性功能低下相关疾病提供新的治疗靶点。.本项目为小额资助项目，在1年执行期内，共获资助人民币16万元，课题组按照合同要求使用经费；参加1次国内学术会议；发表标注本项目资助的SCI收录论文3篇；培养硕士研究生1名。