植物青枯菌VI型分泌系统基因簇影响III型效应子表达的研究

Ralstonia solanacearum is one of the most important phytopathogenic bacteria worldwide, both in terms of host range and destructive capability. The pathogenesis of type III and II secretion system has been clear in R. solanacearum. Type VI secretion system (T6SS) is a novel secretion pathway, which was reported recently. T6SS is bound up with bacterial pathogenicity and virulence. Our previous studies have revealed that type III effectors were increased in tssM mutant in comparison to the wild-type. In this project, using Po82 strain as the research object which was distinct in pathogenicity variation, we plan to study the role of T6SS in regulating the expression of type III effectors via the following aspects: (1) we will delete the whole T6SS gene cluster in R. solanacearum to assess the role of T6SS in basic biological characteristics, such as pathogenicity, motility and colonization. (2) Measuring the expression of type III effectors in T6SS mutant by RealTime-PCR. (3)Analyzing the whole regulation pathway and the mechanism of competition between T6SS and T3SS by transcriptome and high-throughput sequencing technology. This project will help to identify novel virulence effectors and elucidate the molecular mechanism of T6SS affecting type III effectors expression in R. solanacearum.

青枯菌（Ralstonia solanacearum）是一种地域分布广且寄主范围巨大的毁灭性植物病原细菌，在青枯菌致病过程中III型和II型分泌系统的作用已十分明确。VI型分泌系统是新近发现的与致病力有关的系统，我们前期研究发现青枯菌VI型分泌系统核心基因tssM的突变导致部分III型效应子表达明显上调。本研究拟在致病力分化独特的Po82菌株全基因组测序及比较基因组学分析的基础上，通过同源重组方法构建VI型分泌系统基因簇整体缺失突变体，评价VI型分泌系统对致病力、运动性等基础生物学特性的贡献；利用RealTime-PCR技术检测突变对典型III型效应子表达的影响；通过转录组学高通量测序技术(RNA-seq)分析VI型分泌系统对III型分泌系统的整体调控途径及竞争机制，发掘新的青枯菌毒性效应子。为解析青枯菌VI型分泌系统对III型效应子表达调控的分子机制奠定基础。

茄科雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum) ，又称作植物青枯菌，是世界范围内最具有毁灭性的植物病原菌之一，由于青枯菌的致死性和持久性强，并且具有广泛的寄主范围以及广阔的地理分布，因此造成的经济损失巨大。对青枯菌致病性的解析，将为开辟控制青枯病危害的新途径奠定理论基础。.Ⅵ型分泌系统 (type Ⅵ secretion system，T6SS) 存在于各类细菌中，目前主要集中研究人类和动物致病菌中的Ⅵ型分泌系统，研究发现T6SS与病原菌的致病力、细菌竞争及互作等多种生命活动密切相关。研究的前期工作发现T6SS核心基因参与了青枯菌的致病性，并影响了部分III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）效应子蛋白的表达。为深入探索T6SS在青枯菌中的功能及其与T3SS的相互作用机制，本研究开展了相关研究。 .通过转录组分析，发现T6SS基因簇缺失后，植物青枯菌基因组中的两个Ⅰ型信号肽酶基因1716和lepB表达量水平上调，信号肽酶对青枯菌蛋白的分泌起着至关重要的作用，为了更好的研究Ⅰ型信号肽酶在植物病原菌中的作用，探索青枯菌致病的分子机理，本研究对青枯菌Po82菌株中两个I型信号肽酶基因功能进行了研究。.通过同源重组双交换，构建基因缺失载体和互补载体，并筛选获得T6SS基因簇和Ⅰ型信号肽酶单基因（基因1716和lepB）缺失突变株，以及相应的互补菌株。.致病力、高通量转录组RNA-seq和qRT-PCR分析表明，虽然T6SS在青枯菌的致病过程中发挥重要作用，但T6SS基因簇的缺失可能不影响Po82菌株的Ⅲ型效应子基因的表达或影响很小。.两个Ⅰ型信号肽酶基因1716和lepB功能分析表明：1716基因正向调控鞭毛相关基因的表达，1716基因通过影响病原菌Ⅲ型效应子基因的表达，使其致病力下降。而lepB负向调控鞭毛相关基因和Ⅲ型效应子基因的表达。.本研究通过缺失T6SS完整基因簇从全局水平分析了植物青枯菌中T6SS的功能，并检测了T3SS效应子蛋白的表达，确定了T6SS与T3SS的相互作用。