cpcA结合蛋白高效表达及其全局调控机制

目前有关蛋白质分子重组技术的研究主要集中在分子结构简单的单纯蛋白质，而对结合蛋白研究较少。鉴于结合蛋白的特殊生物学活性及其在生物体内含量普遍较低的缺陷，本项目拟探索通过多基因转移的方法构建基因工程菌提高其产量的可行性，为此我们拟以cpcA结合蛋白为例，通过分析其分子结构，特别是辅基与多肽链的结合方式及其生物合成途径，对目的蛋白分子进行有效设计，将其生物合成所需的五个关键基因转移至异源宿主大肠杆菌中，并对基因排列方式、基因之间距离和相邻两个基因间隔区序列进行优化，争取实现cpcA结合蛋白在大肠杆菌中的高效表达，并通过比较转录组学和比较蛋白质组学方法阐明其全局调控机制，从而为后续通过全局代谢工程策略进一步提高其产量奠定基础。本项目的研究不仅可为结合蛋白分子的高效表达提供重要借鉴，而且还将会进一步拓展多基因调控及其互作等方面的研究，促进学科间彼此协作和相互渗透，具有重要的科学意义和学术研究价值。

结合蛋白是生物体内一类重要的生物大分子物质，具有特殊的生物学活性，但在生物体内的含量较低。本项目以藻蓝蛋白α亚基为研究对象，我们根据其生物合成途径，采用合成生物学和代谢工程的手段构建了基因工程菌，提高了藻蓝蛋白的产量，并应用比较转录组学和比较蛋白质组学的方法阐明了其代谢调控机制。主要研究内容包括：极大螺旋藻cpcA生物合成途径五个关键基因的克隆及其序列特性分析；五个关键基因不同组合的大肠杆菌系列表达载体的构建及优化；大肠杆菌的转化，高通量快速筛选模型的建立以及cpcA表达情况的检测与鉴定；cpcA结合蛋白重组大肠杆菌的比较转录组学分析；cpcA结合蛋白重组大肠杆菌的比较蛋白质组学分析。重要结果如下：通过PCR技术克隆了藻蓝蛋白α亚基生物合成途径的5个关键基因，从氨基酸水平上分析的其序列特点。从构建的一系列的表达载体中筛选了能够高效表达藻蓝蛋白α亚基的表达载体，获得了重组大肠杆菌。通过SDS-PAGE，Western-blot和Zn2+荧光进一步分析了藻蓝蛋白α亚基的表达情况。获得了藻蓝蛋白α亚基的吸收光谱和荧光激发光谱数据。获得了藻蓝蛋白α亚基的温度稳定性、pH稳定性的数据以及其清除超氧自由基、DPPH、羟基自由基的相关数据以及其抗细胞氧化损伤的结果。对重组菌发酵生产藻蓝蛋白α亚基的条件进行了研究，首先采用单因素试验，然后采用Plackett-Burman找到了影响其产量的关键因子，最后采用响应面的Box-Behnken对关键因子进行了优化，获得了藻蓝蛋白α亚基高产的关键工艺参数，最后获得的藻蓝蛋白α亚基的产量为22.29 mg/L，为其产业化应用奠定了良好的基础。采用DNA微阵列和二维电泳技术研究了重组大肠杆菌和出发菌株的比较转录组学和比较蛋白质组学，找到了由于藻蓝蛋白α亚基的表达而使重组大肠杆菌中发生明显上调或下调的基因，以及表达发生明显改变的蛋白，阐明了藻蓝蛋白表达的全局调控机制，为通过全局代谢工程进一步提高藻蓝蛋白α亚基的产量奠定了良好的基础。项目研究和实施期间共发表研究论文9篇。本课题将分子生物学先进方法和基因工程技术有机结合起来，不仅可为结合蛋白这类复杂蛋白在异源宿主中的高效表达提供重要借鉴，而且还将会进一步拓展多基因表达与调控及其互作等方面的研究，促进学科间的彼此协作和相互交叉渗透，开拓思路，拓展领域，具有重要的科学意义和学术研究价值。