新型禾本科模式植物二穗短柄草感应真菌相关分子模式几丁质的分子机理研究

Brachypodium distachyon, a new model species for gramineae plant basic research, has a short-life cycle, compact growth, a simple genome, and has had 8X full genome sequencing. Fungus pathogens are one of the major factors contributing to decreased production of Gramineae crops. On the basis of my long-term research on the fungi of Gramineae plants, I conducted preliminary research on the molecular mechanism of the plant cell sensing of fungal associated molecular pattern chitin. Brachypodium cDNA expression microarray and transformation systems are now established. I have studied the effects of chitin on the oxidative status and on the putative chitin receptor. This project aims to determine tissue-specific expression of promoter activity and subcellular localization of the receptor, establish the molecular network of the chitin-sensing mechanism of the plant cells by means of the microarray, and in vivo detection of the oxidative signals.

作为新型旱生禾本科模式植物的二穗短柄草具有生长周期短、基因组简单、植株矮小等适合进行基础研究的优点，并已经完成反复8次的全基因组测序。真菌病害是造成禾本科作物减产的一个主要因素。申请人在长期研究禾本科植物真菌基础上，对二穗短柄草感应真菌相关分子模式几丁质的分子机理进行了初步研究。目前本课题组已经建立拥有自主知识产权的二穗短柄草全基因组表达谱芯片和遗传转化体系，探索了几丁质对植物细胞氧化状态的调节机制，并且初步分析了该植物基因组中可能编码几丁质识别受体的基因。本项目计划确定该受体基因启动子活性的组织表达特异性以及其编码蛋白的亚细胞定位，并在此基础上结合基因表达谱芯片和细胞内氧化物信号活体动态检测技术，建立以该受体为核心的禾本科植物细胞感应真菌性分子模式信号转导的分子网络。

本项目原旨在研究几丁质激发植物防御反应的分子机理，但由于几丁质的难溶性以及短柄草叶片有较厚的蜡质层，即使使用易溶chitooctaose处理短柄草叶片，H2O2信号值不稳定，最高升高倍数不超过3，不适合继续后续的芯片实验。同时根据本课题组研究发现拟南芥的谷氨酸受体通道AtGLR3.3介导[Ca2+]cyt瞬时升高，参与植物的先天性免疫反应。目前拟南芥谷氨酸受体包括离子型谷氨酸受体(iGluRs)和代谢型谷氨酸受体（mGluRs）。iGLRs形成阳离子可渗透的离子通道，如Ca2+，Na+和K +；代谢型谷氨酸受体与G蛋白偶联，参与磷酸肌醇和甘油二酯的形成或环形核苷酸的代谢。AtGLRs的预测蛋白质结构包括保守的跨膜结构域与iGLRs和G蛋白偶联受体（GPCRs）胞外配体结合结构域。目前为止，尚未有短柄草谷氨酸受体基因的相关报道，因此我们于2014年调整研究计划，对短柄草的编码谷氨酸受体通道的基因进行生物信息学分析，研究该基因在短柄草中的表达特异性以及谷氨酸对短柄草[Ca2+]cyt和生长的影响。本项目研究发现短柄草的谷氨酸受体序列类似拟南芥，可能分为三个亚家族；将拟南芥和短柄草的N端和C端进行系统发育分析，发现它们的N端和C端序列差异较大，但短柄草的N端和C端的亲缘关系分别与拟南芥亲缘关系较近，与报道AtGLRs序列上类似于NMDAR型iGLuRs，进化上N端和mGLuRs相关符合。短柄草的GLRs氨基酸序列保守性较强，与拟南芥类似，有三个跨膜结构域M1、M2和M3，两个配基结合域GlnH1（S1）和GlnH2（S2）。BdGLR在根茎叶中表达。利用非损伤测微技术研究发现Glu处理短柄草，引起Ca2+内流，表明谷氨酸很可能参与短柄草的先天免疫反应。植物为了适应胁迫，植物很可能在表型上会和对照不同，用谷氨酸和低钙处理短柄草，发现在500 μM Glu条件下影响根的形态，抑制短柄草主根生长，并且使侧根增加，但不影响株高；然而500 μM Gln处理下的表型与对照相似。短柄草在低钙条件下（<500 μM Ca2+），出现明显低钙敏感表型，叶片发黄，主根被抑制，侧根增多，在500 μM Ca2+以及以上浓度恢复正常表型。