CTLA4通过非经典NF-κB信号通路诱导EC内IDO表达抑制异体复合组织移植排斥反应

Exploring new methods to inhibit rejection response effectively is the major obstacle of composite tissue allotransplantation. Our group found that allograft-expressed CTLA4 was able to suppress rejection response. However, the molecular mechanism is not fully understood. We also found that IDO expression was significantly enhanced in the allografts and the signal molecular of noncanonical NF-κB signal pathway in EC was also enhanced. It has been confirmed by other investigators that IDO expression in ECs was intensively correlated with the unresponsive state of allografts. Thus, we hypothesis that allograft-expressed CTLA4 inhibiting rejection by inducing IDO expression in ECs through noncanonical NF-κB signal. In order to test this hypothesis, we plan to detect the key proteins expression in the noncanonical NF-κB signaling pathways, to detect the IDO expression and to detect the inhibitive effect of IDO metabolites on activated T cell. What's more, we plan to apply IDO blocking agent 1-MT on an AdCTLA4Ig ex vivo transfection animal model and test the IDO expression, IDO metabolites expression and the survival time of allografts. We also plan to test the apoptosis state of infiltrating T cells. This research will help illustrate the molecular mechanism of inhibitive effects of graft-expressed CTLA4 and provide a new thinking to inhibit rejection of composite tissue allotransplantation.

探索抑制排斥反应新思路是异体复合组织移植(CTA)广泛应用的关键。移植物局部表达的CTLA4明显抑制排斥反应，但具体机制不清楚。课题组前期发现，CTLA4局部应用后，移植物中吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达显著升高，血管内皮细胞（EC）中非经典NF-κB信号通路中信号分子表达升高。文献报道，EC中IDO高表达与局部排斥反应抑制密切相关。据此，我们推测CTLA4通过非经典NF-κB信号通路诱导EC内IDO表达抑制排斥反应。课题组拟采用EC模型，检测CTLA4与EC表面受体B7结合后非经典NF-κB信号通路上关键蛋白表达变化，IDO表达变化，以及IDO酶解产物变化诱导T细胞凋亡效应；进一步应用CTLA4局部灌注动物模型，观察IDO阻断剂1-MT对IDO及其酶解产物、移植物存活的影响，并检测浸润T细胞的凋亡。从分子水平阐明CTLA4局部抑制排斥反应机制，为抑制CTA排斥反应提供新思路。

我们前期的研究表明，采用将CTLA4Ig基因载体通过血管蒂灌注的给药方式，CTLA4Ig以游离形式绝大部分位于移植物内，并且可以有效抑制排斥反应，延长移植物存活时间。虽然CTLA4阻断共刺激信号途径的作用机制已研究透彻，但CTLA4在移植物局部发挥免疫抑制作用的机制尚不清楚。我们在EC细胞模型和大鼠同种异体移植模型中验证非经典NF-κB信号通路是CTLA4诱导EC内IDO表达的分子机制，并明确IDO激活后通过其酶解产物诱导浸润T细胞凋亡从而抑制排斥反应。结果显示，CTLA4Ig加入培养液后EC内IDOmRNA水平明显升高，IDO酶活性显著增高，IDO降解产物犬尿酸水平显著升高。将培养液上清加入激活的T细胞中，T细胞增殖速率明显降低。进一步研究表明，CTLA4Ig加入培养液后，NF-κB非经典信号通路上的关键分子磷酸化IKKα蛋白的表达显著升高，而经RNA 干扰处理后，IKKα表达明显下调，内皮细胞IDO表达量明显降低。在体内研究中，首先建立CTLA4Ig基因血管蒂灌注模型，大鼠腹腔注射2mg/KgIDO抑制剂1-MT后，CTLA4Ig延长移植物存活时间的作用被废止，术后5天，检测移植物中IDO mRNA 水平，发现CTLA4Ig诱导局部IDOmRNA表达，当联合应用1-MT则IDOmRNA水平恢复正常。检测移植物中犬尿酸水平，发现CTLA4Ig使局部IDO酶解产物犬尿酸表达升高，联合应用1-MT则使犬尿酸水平恢复正常。因此，我们得出结论，CTLA4Ig诱导大鼠内皮细胞的IDO表达并且能够抑制活化的T细胞增殖；CTLA4Ig诱导EC内IDO表达与非经典NF-κB信号通路关键分子IKKa的磷酸化密切相关；使用IDO阻断剂1-MT可以废止CTLA4Ig引起的移植物延长效果，并且和IDO的阻断密切相关 。本研究证实局部表达的CTLA4作用于EC表面B7，通过非经典NF-κB信号通路诱导IDO表达，使局部色氨酸代谢产物水平升高，抑制激活T细胞增殖，从而抑制排斥反应。本研究将从分子水平阐明CTLA4局部抑制排斥反应机制，为抑制CTA排斥反应提供新思路。