家蚕miRNAs基因对丝素基因表达的转录后调控研究

MiRNA是一类长21-24nt的内源性非编码小RNA分子，参与基因的转录后调节。家蚕是重要的经济昆虫和模式生物，丝素是蚕丝的主要成分，研究家蚕miRNA对丝素基因转录后的调控对阐明蚕丝蛋白表达调控机制以及高丝量蚕品种的培育等具有重要的意义。我们以预测到bmo-miR-2b等多个家蚕miRNAs对3个丝素基因fib-H、fib-L和P25可能存在调控作用。为了研究和阐明其调控作用机制，我们将分析家蚕丝素基因mRNA和预测的miRNAs的表达谱；利用家蚕细胞瞬时表达系统检测家蚕miRNAs与丝素基因的相互作用；利用重组AcMNPV报告基因检测系统等在家蚕体内过量表达家蚕miRNAs，以及人工合成反义核酸分子抑制家蚕内源性miRNAs，研究家蚕丝素基因表达变化，为阐明丝素基因表达调控的分子机制奠定基础。

蚕丝蛋白表达调控是一个复杂的网络，家蚕miRNA（bmo-miRNA）参与了蚕丝蛋白基因的表达调控。本项目利用Solexa测序技术分析获得29个家蚕4龄2d和5龄3d幼虫后部丝腺差异表达miRNAs；生物信息学技术预测获得bmo-miR-2739、bmo-miRNA-965、bmo-miRNA-1926、bmo-miR-2755*、bmo-miR-0001和bmo-miR-0015等多个对丝素基因BmFib-H、BmFib-L和BmP25等具有调控作用的家蚕miRNA。利用RT-PCR技术，分析预测的miRNA和靶基因的表达水平，初步判断它们的调控关系。.为了验证预测miRNA对靶基因的调控作用，以pGL3为载体、家蚕A3启动子驱动的荧光素酶基因（luc）为报告基因，在luc下游连接预测靶基因（BmFib-H、BmFib-L和BmP25，BmSGF-1，BmFMBP-1）的3'UTR，构建靶基因表达质粒；以pCDNA3.0为载体，egfp为报告基因，分别构建家蚕miRNA真核表达载体；miRNA表达载体和靶基因3'UTR表达载体共转染BmN细胞，以海肾荧光素酶质粒pRL做内参，检测细胞荧光素酶的活性；同时，人工合成miRNA的抑制物，进一步验证miRNA的调控作用。细胞水平证实bmo-miR-2739上调丝素重链基因BmFib-H的表达；bmo-miRNA-965和bmo-miRNA-1926能分别下调BmFib-L的表达； bmo-miR-0001和bmo-miR-0015显著下调BmFib-L基因的表达；bmo-miR-2755*可显著下调BmFib-L基因的表达，并能上调BmP25基因的表达，但上调作用未达显著水平。bmo-miR-305*和bmo-miR-3327* 抑制BmSGF-1的表达；bmo-miR-2758抑制BmFMBP-1的表达；bmo-miR-34抑制BmE74的表达；bmo-miR-9a抑制Bm-ase的表达。用人工合成的bmo-miR-9a反义RNA注射预蛹，观察到成虫翅发育受到影响，边缘不整齐。.本研究结果有助于更好地理解miRNA的功能，以及miRNA对靶基因的调控作用，为深入研究bmo-miRNA的功能奠定了良好的基础，也为阐明蚕丝蛋白基因表达调控提供了新的实验数据。