基于微流控梯度液滴阵列技术的定量高通量筛选—基础研究和生化应用

In quantitative high throughput screening (qHTS), each compound is tested at different concentrations against specific biological target to directly obtain the structure-activity relationship of identified compound in primary HTS stage. Thus, qHTS can effectively eliminate the false positive and false negative results that commonly existed in conventional HTS systems. Despite its great potentials, however, qHTS is suffered from complicated liquid handling procedures, low screening throughput, and high sample/reagent consumption. In this proposal, we dedicate to develop a novel sequential injection gradient-microfluidic droplet array (SIGDA) technique to achieve highly versatile quantitative high throughput screening with complete automation and ultra-micro amount sample/reagent consumption. We will combine computational fluid dynamics and experimental methods to build theoretical models for predicting the concentration gradient in droplet array. High sensitive, high dynamic range detection and gradient calibration methods will also be developed to measure the actual concentration in droplets. Based on these fundamental studies, we will apply the SIGDA method in various biological screening systems including enzyme inhibition screening, cell-based toxicity testing, and protein crystallization screening. We envision the SIGDA method can provide a powerful and transformative research tools for drug discovery, toxicology, structural biology, and relative biomedical fields.

定量高通量筛选方法通过在初筛阶段测定样品在多浓度条件下的生物活性，直接得到活性化合物的结构-功能关系，从而有效的消除了常规高通量筛选技术中普遍存在的假阳性和假阴性问题，具有重要的应用前景。然而，定量高通量筛选方法一直受到液体操作繁琐、筛选通量低、试样消耗大等缺点的困扰，导致其难以普及。本项目以研究组的流动注射梯度技术和顺序操作液滴阵列技术为基础，发展多种流动和顺序注射梯度-微流控液滴阵列技术，建立具有高通用型的全自动、超微量的定量高通量筛选方法。结合计算机流体理论模拟和实验方法，建立适用于液滴内浓度梯度预测的理论模型，并发展多种高灵敏度、高动态范围的液滴内样品浓度检测和梯度校正方法。在此基础上，将该方法应用于分子水平的酶抑制剂筛选、细胞水平的化合物毒性测定、以及蛋白质结晶条件筛选等生化筛选领域，为我国的新药研发、毒理学、结构生物学等生物医学领域提供有力的研究工具，促进相关学科的发展。

根据项目设定的研究目标和计划，项目团队发展了一种新型的纳升级定量高通量筛选技术和方法，建立了一整套集成液滴生成、混合、反应孵育以及荧光检测的全自动化筛选装置，并应用于高通量、低消耗酶动力学分析、酶抑制剂筛选、以及蛋白质结晶条件筛选等生化分析中。我们发展了一种独特的基于单边扩散的浓度梯度生成方法，具有操作简单、可靠性高、特别适合纳升级 别的定量高通量筛选。采用本系统，我们选取了含有102化合物的分子库进行MMP-9的抑制剂筛选。液滴体积4 nL，每个化合物筛选24个不同的浓度，共进行了2448个酶抑制反应测定，MMP-9酶的总消耗仅为9.8uL。其样品消耗比常规基于384孔板的筛选降低了1600倍以上。针对蛋白质结晶的瓶颈问题，基于本液滴梯度技术，我们发展了一种高分辨率批式筛选方法，并用于蛋白质结晶条件的全面筛选。仅仅使用19.2 uL蛋白质样品溶液，我们可以实现480种不同沉淀剂以及12种不同蛋白质浓度的快速筛选。与常规单浓度批式筛选方法相比，高分辨批式筛选方法可提高筛选成功率约30%至90%。此外，在本项目的支持下，研究组还发展了基于纳升级液滴阵列的多体积数字PCR技术、基于热稳定性的蛋白质小分子配体筛选技术、以及基于电喷雾质谱检测的无标记液滴分析系统。上述成果有望应用于新药研制、结构生物学研究、以及重大疾病的诊断以及治疗中。