小麦耐盐基因发掘及耐盐机理研究

Soil salinity is one of the most severe abiotic stresses that affect wheat production. The identification of salinity tolerance genes is one of the key issues for breeders to improve salinity tolerance of wheat. In our previous studies, 419 wheat core collections from China and Australia were used to investigate the genotypic variation and identify quantitative trait loci (QTL) for salinity tolerance. All genotypes with no Na+-exclusion genes were sensitive salinity stress. Significant differences in salinity tolerance were also found among genotypes with Na+-exclusion gene, indicating the existence of other mechanism/genes involved in salinity tolerance. QTL for salinity tolerance were identified on 5A and 5B via genome-wide association analysis. Based on these studies, the main objectives of the current project are to: (1) isolate and clone salinity tolerance-related genes according to transcriptome and GWAS results; (2) confirm the function of the gene(s) on the capacity of ion transport using heterologous expression system of Xenopus oocytes; (3) explicit the subcellular and tissue localization of the gene by using GFP and immunofluorescence; (4) reveal the function and regulatory network of the gene using overexpression, CRISPR/Cas9 and BSMV-VIGS; (5) determine the hormone signaling molecules which are involved in the regulation of regulatory network of the gene(s). The major outcomes of this project is the understanding of physiological and molecular mechanisms of non-Na+-Exclusion salinity tolerance gene(s), and open novel prospective for the improvement of salinity tolerance in wheat as well as other crops.

土壤盐害是限制小麦产量的一个重要因素，明确小麦耐盐机理，发掘耐盐关键基因可为小麦耐盐性遗传改良提供重要依据。我们前期试验对419份小麦种质进行了耐盐性鉴定和遗传多样性分析，发现不含排钠基因的小麦基因型表现为盐敏感，但含排钠基因的小麦基因型在盐耐性上也存在非常显著的差异，随后采用关联分析在5A和5B染色体上发掘出两个耐盐主效QTL。在此基础上，本项目的主要研究内容有：（1）利用转录组测序结合关联分析结果，分离克隆耐盐关键基因；（2）利用爪蟾卵母细胞异源表达系统，明确基因对离子的转运能力；（3）采用免疫荧光和GFP亚细胞定位技术，明确其组织和亚细胞定位；（4）采用超表达、CRISPR/Cas9和BSMV-VIGS技术，结合全转录组及甲基化测序，明确耐盐基因功能及其调控网络；（5）明确参与耐盐基因及其互作基因调控网络的激素信号分子。研究结果将阐明小麦非排钠耐盐基因的耐盐机理，丰富作物耐盐理论。

土壤盐害是全球范围内影响作物产量和品质的主要逆境之一。本课题以334份小麦核心种质为试验材料，通过全基因组关联分析、转录组学、单倍型分析等技术发掘出了小麦耐盐关键基因TaHAK；在此基础上，采用基因沉默、过表达、异源表达等技术研究了TaHAK在调控小麦耐盐性中的作用机制；采用原位-PCR、亚细胞定位等技术明确了TaHAK的表达模式。连续三年土培试验结果表明334份小麦种质表现出显著的耐盐性（SDS）和钠钾离子含量差异，从中筛选出耐盐性极强的小麦种质，并在盐碱地中对其耐盐性做了进一步验证。通过全基因组关联分析（GWAS）在染色体1B、2B和5A上鉴定到7个SDS相关QTL位点，并在QTL所在区间内筛选到19个耐盐相关候选基因；在染色体5A、6B和7A上鉴定到3个与钾离子含量相关的QTL，其对钾离子含量表现出显著的等位基因效应；鉴定到6个与钠离子含量相关QTL，在钠钾离子含量相关QTL区间范围内鉴定到86个候选基因。采用转录组测序技术分析了不同时间点盐处理条件下不同盐耐性种质中候选基因表达量的变化，结果发现有31个基因存在差异表达。基于以上GWAS和转录组关联分析结果，我们重点分析了TaHKT23和TaHAK。单倍型分析结果显示，TaHAK在不同种质中存在序列差异，且该变异与表型显著相关，而TaHKT23未发现差异，表明TaHAK可能在小麦耐盐性中发挥重要作用。进化分析结果显示，TaHAK可能起源于藻类；该基因的表达量随盐处理时间的延长先上升后下降；亚细胞定位显示TaHAK定位于细胞膜；原位PCR技术发现TaHAK在根中主要定位在中柱和表皮细胞，且在中柱鞘和木质部薄壁细胞中的表达丰度最高。采用BSMV-VIGS系统瞬时沉默小麦TaHAK，与接种空载体小麦植株相比，TaHAK沉默植株表现出更强的耐盐性和较低的地上部和地下部钠离子和钾离子含量；在小麦中过表达TaHAK后，对照条件下，野生型和过表达株系生长无显著差异，但盐处理10天后，与野生型相比，过表达株系的生长受到更明显的抑制，且根系钠离子荧光强度显著强于野生型。TaHAK水稻异源表达结果显示，盐处理10天后，与野生型相比，2个过表达株系生长受到显著抑制，地上部钠离子含量显著增高；转运活性分析表明TaHAK具有钾离子转运活性。研究结果解释了小麦耐盐机制，丰富了作物耐盐理论，为培育强耐盐、优质小麦新品种提供了理论基础。