乙烯响应因子ZmERF1在玉米籽粒发育中的功能及调控机制研究

The ERFs (ethylene response factors) are plant-specific transcription factors that play very important roles in plant growth and development, senescence, stress response and hormonal regulation. In our previous research, a gene encoding a putative ethylene response transcription factor, named ZmERF1, was cloned from suppression subtractive hybridization libraries, which were constructed at the key endosperm development stages of maize. Preliminary studies have showed that ZmERF1 might be related with kernel development and maturation dehydration. Further researches in this study are as follows: (1) the sequence diversity and its association with kernel traits will be analyzed, and the elite alleles will be mined; (2) the interference and overexpression vectors of ZmERF1 drived by the endosperm-specific and constructive promoter will be constructed, respectively. These vectors will be transformed into maize, and their effects on grain cell development, grain filling rate and grain weight will be analyzed; (3) the interacting proteins with ZmERF1 will be screened by yeast two-hybrid, and the interaction network will be constructed; (4) the binding target sequences of ZmERF1 will be obtained using ChIP-seq technology, and the regulation network will be reconstructed. These results will uncover the function and regulation mechanism of ZmERF1 in the grain development, meanwhile provide a new gene for molecular breeding and lay good foundation for screening elite germplasm resources in maize.

乙烯响应因子（ERF）是植物特有的一种转录因子，在植物的生长发育、衰老凋亡、胁迫响应和激素调节等方面发挥着十分重要的作用。从课题组前期构建的玉米胚乳发育关键时期抑制差减杂交文库中克隆了一个乙烯响应转录因子基因ZmERF1，初步分析表明其与玉米籽粒发育、脱水成熟相关。本项目拟开展研究内容：①分析ZmERF1等位基因序列变异及其与籽粒性状的关联性，挖掘优异等位基因位点；②构建分别由组成型启动子和胚乳特异型启动子驱动ZmERF1的干扰表达和超表达载体，进行玉米遗传转化，研究ZmERF1不同表达水平对籽粒发育、灌浆速率和粒重等性状的影响；③利用酵母双杂交筛选与ZmERF1互作的蛋白分子，构建蛋白互作网络；④利用ChIP-seq筛选ZmERF1蛋白结合的靶序列，构建其调控网络。本研究将揭示ZmERF1在玉米籽粒发育中的功能及其调控机制，并为分子育种提供新基因以及筛选优异种质资源奠定基础。

乙烯响应因子是植物中特有的一类转录因子，在植物的生长发育、衰老凋亡、胁迫响应和激素调节等方面发挥着重要作用。本研究在对ZmERF1蛋白的转录激活活性和靶序列结合活性分析基础上，利用NaCl、温度和PEG分别对玉米自交系N04幼苗进行胁迫处理，ZmERF1表达受盐、温度和干旱等胁迫影响；在拟南芥中ZmERF1启动子受植株生长发育时期和组织器官部位的影响，同时受逆境胁迫诱导表达；在拟南芥异源过表达ZmERF1，增强了转基因植株对高温、盐浓度和渗透等逆境胁迫的抗性，同时提高了下游抗逆性基因、ABA及乙烯合成相关基因的表达水平。通过分析不同玉米自交系中ZmERF1序列特征及其在籽粒发育中的表达特点，表明不同自交系具有不同的表达模式，ZmERF1可能参与了不同的调控网络。通过预处理玉米幼胚以及共培养培养基盐浓度和愈伤组织再生培养基优化，建立了玉米自交系B104的遗传转化体系。构建了由组成型启动子和胚乳特异型启动子驱动ZmERF1基因的干扰表达和超表达载体，并转化到玉米自交系KN5585和B104中，表明在玉米自交系KN5585籽粒中干扰ZmERF1表达会导致籽粒穗萌发现象。构建了ZmERF1的CRISPR基因编辑载体，转化玉米自交系B104并获得3个编辑突变体。在检验ZmERF1蛋白毒性实验和自激活活性基础上，利用酵母双杂交筛选与ZmERF1互作的蛋白分子，获得5个可能与ZmERF1互作的蛋白分子；并验证ZmERF1与ZmEIL1、GRMZM2G025109蛋白存在互作。通DAP-seq技术筛选了ZmERF1蛋白调控的DNA靶基序，共获得57个ZmERF1蛋白结合的DNA基序。本研究揭示了玉米乙烯信号转导基因ZmERF1在逆境胁迫和籽粒发育中的功能及调控机制，为优异玉米种质资源筛选奠定了基础。