大鼠miR-29a与肝再生的关系及其作用机制研究

Damage to the liver is often associated with dysfunctional healing that overrides liver regeneration, which often causes liver fibrosis and results in hepatitis, cirrhosis. Understanding the multi-cellular crosstalk that balances regeneration and aberrant healing during liver repair will be of great importance in developing treatment for liver diseases. Through miR-29a target scanning in rat, we found HMGB1, SGK1, TEC etc. genes were involved in liver regeneration. Little evidence showed that miR-29a expression increased after partial hepatectomy, then down-regulated in later stage. But it is unclear whether miR-29a involves in liver regeneration. In this study, we will use the miR-29a knockout rat which has been established in our lab, together with partial hepatectomy and carbon tetrachloride induced liver injury to illuminate the relationship between miR-29a and liver regeneration. The real-time PCR will be used to determine the expression of the potential targets of miR-29a in liver regeneration. Then the target will be verified by dual-luciferase reporter assays．Further, over expression of verified target gene in hepatic tissue could be achieved based on adenovirus system. The signal pathway of the target gene involved in the liver regeneration will be defined.

肝损伤后往往伴随着异常修复，当异常修复超过肝再生时，常导致纤维化，进而发展为肝炎、肝硬化等疾病。肝修复过程中，肝再生和异常修复之间的平衡偏移，受到多种肝脏细胞间相互作用的调控，明确这种调控机制对于确定肝疾病的治疗策略具有重要意义。在大鼠中对miR-29a的靶点预测，发现HMGB1、SGK1、TEC等多种与肝再生相关的基因。研究发现肝再生起始阶段miR-29a高表达，后期表达降低。但miR-29a是否参与肝再生过程、及其作用靶点和机制尚不清楚。本项目拟利用已建立的miR-29a敲除大鼠，结合部分肝切除和四氯化碳肝损伤模型，研究miR-29a缺失对肝再生的影响。利用Real-time PCR分析miR-29a的潜在靶点的表达情况，通过双荧光素酶报告系统明确miR-29a在肝再生中的作用靶点。在此基础上，利用腺病毒介导体细胞转基因技术，研究靶基因过表达在肝再生中的作用，并明确相应的信号通路。

肝脏拥有惊人的再生能力，但在一些慢性或急性损伤情况下，会造成肝脏再生能力的下降甚至丧失，进而导致肝硬化、肝炎以及肝癌。深层次了解肝再生的调控机制，寻找肝再生过程中关键调控节点，将为肝脏疾病的治疗提供潜在的药物靶点。microRNA是一类小的非编码RNA，通常通过调节转录后基因的表达水平，影响基因的表达。越来越多的研究表明microRNA在肝脏再生中发挥着重要的作用。miR-29a 是miR-29家族成员之一，前期研究表明miR-29a 在脂质代谢、纤维化和细胞凋亡中发挥重要的调节作用。研究还发现miR29a在肝损伤引起的肝脏再生过程中早期高表达，在肝脏再生的中期和后期表达降低。关于miR-29a对肝脏再生的影响机制尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了miR29a敲除大鼠，结合70%肝脏切除技术，研究miR29a对肝脏再生的影响及其作用机制。通过对敲除大鼠和野生型大鼠进行肝脏部分切除手术(（3h,24h,48h,72h,96h）)，发现miR29a敲除影响肝脏再生进程，其中肝重体重比在不同时间点都有降低， BrdU染色结果也表明miR29a敲除影响肝细胞增殖能力。随后，我们利用real time PCR对miR29a的潜在靶点进行筛选，发现Hmgb1、Rab30、Tnfrsla、Sgk1、Hbp1、Pten和Setd8在miR-29a敲除后的肝再生早期表达升高，蛋白水平Hmgb1的升高明显，并通过双荧光素酶实验验证了Hmgb1是miR29a的靶点。随后对可能的信号途径分析，结果表明，miR-29a影响肝再生过程是通过miR29a-5p作用于靶点Hmgb1，并通过调节ERK信号途径来影响肝再生进程的。本研究为治疗肝脏疾病的治疗以及促进肝脏再生进程提供了新的作用靶点。