降钙素基因相关肽（CGRP）在低强度脉冲超声（LIPUS）促进骨质疏松大鼠骨结合中的作用机制研究

Dental implant restorations have become one of the most common restoration methods for missing teeth, because they are close to natural teeth. However, in patients with osteoporosis, due to the possible presence of poor bone quality and insufficient bone mass, poor bone integration may affect success rate of implant. Low intensity pulsed ultrasound (LIPUS) is widely used in the treatment of osteoporosis and bone fracture healing as a safe and non-invasive method with no side effects and low price. We also found that LIPUS can promote the osseointegration of ovariectomized rats in our previous studys, but its specific biological mechanism is not yet clear. In 2016, some researchers reported on Nature Medicine that the neurotransmitter calcitonin gene-related peptide (CGRP) secreted and released by the sensory nerve plays a decisive role in the process of bone fracture healing. Similar to the biological processes associated with fracture healing and osseointegration, we hypothesized that CGRP may also play a decisive role in osseointegration and we found that LIPUS promoted the release of CGRP in previous studies. This project intends to perform LIPUS stimulation on rats with osteoporosis and to study the mechanism of sensory nerves and CGRP in promoting bone osseointegration in LIPUS. This will provide certain theoretical basis and technical support to improve the success rate of dental implant in patients with osteoporosis.

种植牙已成为牙缺失后首选的修复方式。但对骨质疏松患者，因可能存在骨质不佳、骨量不足等问题，导致种植体骨结合不良而影响种植成功率。低强度脉冲超声（LIPUS）广泛应用于骨质疏松和促进骨折愈合的治疗，具有安全无创、无副作用、价格低廉等优点。本课题组前期研究中发现LIPUS能促进骨质疏松大鼠种植体骨结合，但其具体生物学机制尚不清楚。有研究报道(Nature Medicine, 2016)，感觉神经分泌释放的神经递质降钙素基因相关肽(CGRP)在骨折愈合过程中起决定性作用。而骨折愈合与骨结合存在相似的生物学过程。因此，本项目假设CGRP在种植体骨结合中也有决定性的作用，并且在前期研究中已发现LIPUS能促进CGRP的释放。本项目拟进一步对骨质疏松大鼠进行LIPUS刺激，研究感觉神经和CGRP在LIPUS促进种植体骨结合的机制。预期实验结果将为提高骨质疏松患者牙种植成功率提供一定的理论和实践依据。

本课题组在前期的研究中已经发现LIPUS能够促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和迁移，并向成骨分化。为研究LIPUS对骨质疏松患者种植体骨结合的具体作用机制，本课题组进行了动物实验及细胞生物学实验。本项目主要探索的科学问题有感觉神经是否参与了LIPUS的刺激传递和CGRP的释放；CGRP是否为LIPUS促进骨质疏松大鼠种植体骨结合的关键神经递。.本项目在实施过程中分为两个阶段。第一阶段研究的内容为感觉神经是否参与了LIPUS的刺激传递，是否能释放神经递质CGRP。本课题组在制备了骨质疏松大鼠模型基础上，进一步建立大鼠种植体模型——于大鼠双侧胫骨干骺端植入种植体。随机选择半数大鼠在在3-5腰椎皮下连续3天注射高浓度辣椒素——以阻断感觉神经的信号传递。每天对种植体部位给予低强度脉冲超声（LIPUS）的刺激20min，持续四周。micro-CT检测种植体周围骨组织骨结合率、骨体积分数、骨小梁厚度；ELISA检测CGRP含量；硬组织切片及骨组织石蜡切片观察骨结合情况。.第二阶段研究CGRP是否为LIPUS促进骨质疏松大鼠种植体骨结合的关键神经递以及CGRP是否具有促进BMSCs增殖和成骨分化和细胞迁移的作用。动物实验与上一阶段相近，区别在于此阶段使用腺相关病毒感染胫骨骨髓腔达到上调、拮抗或正常的CGRP释放，用以研究CGRP在lipus中起着决定性的作用。之后，提取大鼠BMSCs进行细胞生物学实验，使用0mol/L、10-10mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L四种浓度的CGRP对BMSCs进行处理，之后进行CCK-8、ALP、OCN 以及RT-PCR检测。.结果显示：LIPUS处理组的骨结合率、骨体积分数、骨小梁厚度及CGRP含量均显著高于对照组。LIPUS处理组种植体周的骨组织细胞层数多于对照组。辣椒素处理的大鼠无论是否进行超声处理，骨结合率、骨体积分数、骨小梁厚度及CGRP含量明显低于非辣椒素处理组。结果提示，低密度脉冲超声可以增加骨质疏松大鼠种植体周围的早期骨结合和新骨形成；低密度脉冲超声促进感觉神经释放降钙素基因相关肽可能是其促进骨质疏松大鼠种植体周围早期骨结合及新骨形成作用的重要机制之一。