基于光遗传学技术研究细胞骨架网络对肿瘤细胞群体迁移的调控作用与生物力学机制

Cell migration is a key step in many physiological and pathological processes and plays an important role in the development, metastasis, recurrence and prognosis of tumors. Although epithelial mesenchymal transition (EMT) is a good explanation for the migration mechanism of individual cells, the molecular mechanism of more efficient collective cell migration is poorly understood. Based on the combination of cell biology, biomechanics, molecular biology and optogenetics, this project will establish 2D and 3D models of collective cancer cell migration and study the mechanical regulation mechanism of collective cancer cell motility under photoactivation or photoinhibition conditions. Through the study of the leader cells, this project aims to reveal the special role of leader cells in guiding collective cancer cell migration, the use of optogenetics will induce the reconstruction of several leader cells and affect the crosstalk among cells. The effect from microenvironment through transmembrane proteins and Rac will regulate leader cells and further reveal the mechanistic balance between myosin and microtubules. The results of the project not only help to understand the molecular basis of tumor cell collective migration from a biomechanical point of view, but also open up entirely new ideas for the mechanism of tumorigenesis and preventions from the perspective of optogenetics.

细胞迁移是许多生理和病理过程中的关键步骤，在肿瘤发生发展、转移、复发及预后中起到重要作用。尽管上皮间充质转化（EMT）很好的解释了个体细胞的迁移机制，但更为高效的群体细胞迁移的分子机制还知之甚少。本项目立足于细胞生物学、生物力学、分子生物学和光遗传学技术的结合点，建立肿瘤细胞群体迁移的2D和3D模型，在光激活或光抑制条件下研究群体肿瘤细胞迁移的力学调控机制。通过对前导细胞的研究揭示其引领群体肿瘤细胞运动的特殊作用，利用光遗传学技术诱导重建多个前导细胞并探究其对群体细胞交互对话的影响。进而分析微环境通过跨膜蛋白和Rac调控前导细胞的机制并探究前导细胞中肌球蛋白和微管的力学平衡规律。项目研究结果不仅有助于从生物力学角度认识肿瘤细胞群体迁移的分子基础，而且将从光遗传学的角度为肿瘤发生机制研究和在侵袭转移水平上的防治开辟全新的思路。

本项目选择具有群体迁移特性的乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，利用慢病毒转染手段构建三种具有不同肌球蛋白活性的细胞株。通过Western Blot实验验证稳定转染细胞株已经成功构建，并使用其进行实验。通过延时摄影研究伤口愈合过程发现肌球蛋白活性的增加抑制了肿瘤细胞的群体迁移，而失活的肌球蛋白则造成了相反的结果。为了阐明造成这种现象的原因，我们分别对影响细胞群体迁移的三个因素：细胞极性、细胞收缩力和黏附力进行了探究。结果发现虽然活化的肌球蛋白增加了细胞收缩力，但是影响了力在细胞群体内的极性分布。群体细胞迁移的方向性减弱，失去定向极化，并且细胞与基质的黏附力大大增加，这三个因素的共同作用导致群体迁移的速度下降。FAK作为一种酪氨酸激酶不仅可以调节细胞黏附，还可以通过Rho-ROCK通路调节细胞收缩力的大小，并且FAK自身作为机械敏感分子，还会对细胞内外的机械力学信号做出响应。因此我们进一步探究了肌球蛋白活性的改变如何影响FAK-Rho-ROCK信号轴，我们通过免疫荧光和Western Blot实验证明了高细胞收缩力会导致FAK的活化，即FAK在Y397位点的磷酸化程度增强。通过光遗传实验抑制细胞内的肌球蛋白活性发现细胞FAK活性降低，说明FAK活性的降低是由于收缩力降低导致的。接下来通过细胞荧光共振能量转移实验证明，高收缩力会使FAK的分子构象发生改变，导致FAK在Y397位点处发生磷酸化而被激活。免疫荧光实验和Western Blot实验发现，FAK的活化会使下游Rho-ROCK信号通路激活，并使用了光遗传实验和抑制剂进行验证。最后我们在高肌球蛋白活性的细胞群体中加入pFAKY397抑制剂后进行细胞划痕实验，结果发现其迁移能力得到恢复。.综上所述，我们发现活化的肌球蛋白通过高细胞收缩力改变FAK的分子结构从而导致FAK的活化进而激活Rho-ROCK通路，使胞内收缩力得到进一步加强，形成正反馈循环。本项目阐明了肌球蛋白不仅位于FAK-Rho-ROCK信号轴的终点，还可以通过机械力学信号影响其上游信号通路，为探明乳腺癌细胞群体迁移机制提供了新的研究方向。