SphK1在肝衰竭枯否细胞TLR4通路介导炎症损伤中的作用机制

在前期工作发现MHV-3感染和D-GalN/LPS急性肝衰竭小鼠和肝衰竭患者血清SphK1水平增高，SphK1抑制剂显著降低血清HMGB1水平和提高肝衰竭小鼠生存率的基础上。进一步研究SphK1和枯否细胞在D-GalN/LPS和MHV-3感染肝衰竭发生中的作用。体外细胞水平研究SphK1在LPS刺激枯否细胞和巨噬细胞NF-κB活化、HMGB1和炎症因子 (TNF-α,IL-1β、IL-6) 释放中的作用以及对抗炎因子IL-10的影响。实验研究SphK1是否通过TLR4信号通路PKCδ参与枯否细胞NF-κB活化以及SphK1在TNF-α刺激枯否细胞NF-κB活化、HMGB1释放中的作用。进一步弄清SphK1在肝衰竭枯否细胞TLR4通路及其炎症损伤发生中的机制，为肝衰竭的治疗提供新的干预靶点。

近来发现，SphK1在脓毒血症炎症反应中发挥重要作用，而急性肝衰竭具有相似的全身性炎症反应综合症。前期发现急性肝衰竭小鼠PBMC表达SphK1升高，SphK1抑制剂（DMS）显著降低血清HMGB1水平，提高生存率。.本项目建立和优化D-GalN/LPS诱导的BALB/c小鼠急性肝衰竭模型；氯化钆清除枯否细胞提高肝衰竭小鼠生存率、降低12h血清TNF-α,IL-1β、IL-6和HMGB1水平，减轻肝脏炎症坏死，降低肝脏SphK1表达。LPS刺激肝脏主要组成细胞（枯否细胞、原代肝细胞、肝星状细胞）仅枯否细胞SphK1表达，免疫组化示肝细胞表面无SphK1表达。表明，肝脏SphK1表达主要来源为枯否细胞。.LPS刺激枯否细胞12h 的TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1水平显著升高； Sphk1-siRNA和DMS降低上述细胞因子水平。 DMS降低急性肝衰竭小鼠血清S1P水平，提高生存率，降低12h血清ALT/AST、TNF-α，IL-β和IL-6和HMGB1水平，减轻肝组织炎症坏死和肝细胞HMGB1胞浆移位。提示枯否细胞SphK1活化在急性肝衰竭中具有重要作用。.磷酸化PKC-δ在急性肝衰竭小鼠PBMC和肝组织表达，PKC-δ抑制剂Rottlerin提高生存率，降低12h的血清ALT/AST水平、血清炎症因子(TNF-α，IL-β和IL-6)和HMGB1水平以及36h肝组织炎症坏死。LPS刺激小鼠枯否细胞PKC活性增加，SphK1 -siRNA和DMS抑制LPS刺激的PKC活性；重组人PKCδ和S1P共孵育， PKC活性升高。DMS抑制PBMC和肝组织PKC-δ活化，DMS和Rottlerin均可抑制LPS刺激枯否细胞NF-κB的活性。提示，SphK1依赖PKC-δ活化促进枯否细胞NF-κB活性参参与急性肝衰竭炎症反应。.TNF-a刺激小鼠枯否细胞SphK1表达和HMGB1水平升高，NF-κB活性增加。SphK1-siRNA和 DMS对TNF-a刺激枯否细胞HMGB1和NF-κB活性无影响。提示，SphK1不参与枯否细胞TNF-a信号通路NF-κB活化。.综上所述，枯否细胞SphK1活化促进PKC-δ磷酸化，进而促进NF-κB和炎症因子释放在急性肝衰竭中具有重要作用。进一步明确SphK1在肝衰竭枯否细胞TLR4通路炎症损伤发生中的机制，为治疗提供新的干预靶点。