Calcimycin （A23187）构造单元－苯并噁唑环生物合成机理研究及其组合生物合成

Benzoxazole antibiotics are a kind of structurely unique nitrogen heterocyclic compounds, which exhibit a wide range of biological activities, such as antibacterial, antiviral and antitumor activities. However, less research was done on the biosynthesis mechanism of benzoxazole antibiotics, and the biosynthetic pathways of benzoxazole ring have not been elucidated until now. We choose benzoxazole antibiotic calcimycin (A23187) as research template. On the basis of cloning the whole gene cluster of calcimycin from the Streptomyces chartreusis NRRL3882, we will explore the biosynthesis mechanism of benzoxazole and reveal the unique biochemical reactions functions of genes involving in the benzoxazole biosynthesis by the methods of bioinformatics analysis, gene disruption and enzymatic activity in vitro. Furthermore, the illumination of the complete biosynthetic pathways of calcimycin sheds new insights into calcimycin derivatives, and synthetic biology provides a powerful strategy for further obtaining new benzoxazole compounds with novel structure and enhanced activity by microbial genetic engineering and combinatorial biosynthesis.

苯并噁唑类抗生素作为一类结构独特的含氮杂环化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等广泛的生物活性。目前，关于此类化合物的生物合成机制研究较少，其特殊结构单元——苯并噁唑环的生物合成途径一直悬而未决。本项目拟以教酒链霉菌NRRL3882产生的苯并噁唑类化合物calcimycin作为研究模板，在获得calcimycin生物合成基因簇基础之上，通过生物信息学分析、基因敲除和体外酶催化反应等方法，从分子水平上阐明苯并噁唑环的生物合成机理。在全面理解calcimycin的生物合成途径的基础上，运用组合生物合成的理念，通过设计及运用已有的苯并噁唑环结构单元结合已知功能的生物元件构造新的生物合成途径，以此获取结构新颖、活性提高的非天然的苯并噁唑类化合物。

卡西霉素（calcimycin）为一大类含苯并噁唑环结构的抗生素的代表性化合物，该类抗生素具有抗菌、抗病毒等广泛生物活性，而其中苯并噁唑环的生物合成途径一直未知。calcimycin由教酒链霉菌（Streptomyces chartreusis）NRRL 3882产生，前期工作中我们已获取calcimycin的完整生物合成基因簇，本项目拟探究其具体生物合成途径，尤其是苯并噁唑环的生物合成机理。. 我们通过敲除calB1-calB4 基因，证实 calB1-calB4 基因参与苯并噁唑环结构单元合成前体物3-羟基邻氨基苯甲酸的生物合成。为了探明苯并噁唑环的形成机理，我们利用生物信息学手段及PCR-targeting 方法对calcimycin生物合成基因簇上的其它功能基因（calC，calD，calA3，calG，calF，calR1，calR2，calR3）及未知基因（calU1，calU2和calU3）进行了研究，获得15个基因分别中断的突变株，并分别对以上突变株进行了发酵及代谢产物分析，研究它们在calcimycin生物合成中的作用。.在体内实验的基础上，我们对其中部分基因进行体外的克隆和表达，建立并优化表达条件，获得CalC，CalG，CalU2，CalU3及CalR3的可溶性蛋白。通过体外生化实验证实CalC能够活化cezomycin，使其与CoA结合，而CalG能够抑制cezomycin与CoA的结合，这两个基因共同作用，调节cezomycin向终产物calcimycin的转化；CalR3为负调控基因, 通过finger-printing方法测定了CalR3的结合位点，发现它结合于calR3与calT之间的双向启动子位置，通过对自身进行负反馈抑制来保持自身及calT的低转录水平。通过对calcimycin生物合成途径的细致分析并结合体内基因敲除及体外生化结果，提出苯并噁唑环上的氨基是在生成calcimycin的中间体cezomycin之后修饰上去的，即3-羟基邻氨基苯甲酸在生成苯并噁唑环之前并没有氨基化；CalU2在酰胺键的形成及脱水环化形成苯并噁唑环的过程中发挥作用。研究对原先基于生物信息学分析及个别基因的体内实验预测的calcimycin生物合成途径进行了修正，并提出了更为合理的生物合成模型。