胃癌细胞球免疫表型的检测及RNA干扰CD133、CD44及Oct-4对其侵袭性与致瘤性影响的初步研究

探索胃癌发病、复发转移的机制为当前研究热点之一。研究证实肿瘤组织中含一小部分可无限增殖且能在动物体内形成移植瘤的肿瘤干细胞，但目前胃癌肿瘤干细胞缺乏公认的较特异的标志物，其分选和鉴定方法亦处于探索阶段，难以进行针对胃癌肿瘤干细胞为靶点的抗肿瘤研究。直接分离胃癌肿瘤干细胞来进行相关研究目前尚较困难，基于肿瘤细胞球含有肿瘤干细胞这一事实，能否利用胃癌细胞球的免疫表型来探讨胃癌肿瘤干细胞标志物？能否以胃癌细胞球及其表面标志物作为靶点的抗肿瘤研究来探索胃癌的生物治疗？均为本课题拟解决的关键问题。本研究拟通过免疫荧光、免疫细胞化学、RT-PCR检测胃癌细胞球可能的免疫表型（CD133、CD44 、Oct-4及Lgr5）；研究胃癌细胞球对放、化疗的敏感性；对胃癌细胞球上述表面标记物进行RNA干扰后，观察其侵袭性及致瘤性变化。本研究可能发现胃癌肿瘤干细胞较特异的标志物，为胃癌生物治疗奠定理论基础。

本研究发现从胃癌患者原发灶及外周血中分离出的CD44+CD54+细胞亚群能形成细胞球，并具有自我更新、多向分化及成瘤能力，以上均为肿瘤干细胞的标志性特征。PDGFRA特异性表达于循环肿瘤干细胞，并通过自分泌和血小板PDGF活化；其活化维持了循环肿瘤干细胞的生存，防止AKT通路引起的自噬。胃癌组织的免疫组化结果显示CD44、CD54表达于细胞膜。CD44强阳性与肿瘤大小、pN、pTNM分期和预后相关；CD54强阳性则与患者年龄、肿瘤大小相关。在胃癌和邻近正常组织的比较中，定量PCR显示CD44与大体分型、分化、pT、pN、pTNM分期和预后相关；CD54与pTNM分期和大体分型相关；Lgr5与分化和pN分期相关；EpCAM与肿瘤大小、大体分型和pN分期相关。Oct4和CD133均与肿瘤临床病理学特征无显著相关。胃癌干细胞免疫细胞荧光显示CD44、CD54、Lgr5和HER-2于细胞膜表达；EpCAM、CD133在某些细胞胞核中表达；Oct4于细胞浆表达。5-Fu和奥沙利铂共培养后，CD44比例均有不同程度提高。用慢病毒RNA干扰CD44表达后，观察到干扰组和空载组体外增殖水平虽无显著差异，但通过transwell和化疗处理后发现，较空载组而言，干扰组的迁移性、侵袭性和IC50有明显下降。软琼脂克隆形成实验显示空载组克隆形成率为1.3%，而干扰组为0.11%。小鼠移植瘤模型发现，干扰组在成瘤率和成瘤体积方面明显低于空载组。基因芯片显示，干扰CD44后，与促进血管形成、肿瘤发生、维持干细胞特性和化疗耐药等相关的多个基因下调，而与肿瘤抑制相关的多个基因表达上调。