基于病毒免疫逃逸策略设计新型双功能重组腺相关病毒载体

In order to evade immune recognition and to spread, viruses have developed multiple strategies to limit the presentation of viral epitopes from infected cells to cytotoxic T lymphocytes (CTL). Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) silencing is one elegant strategy for viral evasion, because the size of peptides produced by ERAP1 (eight to nine residues) is precisely that required for stable binding to MHC class I. The recognition of viral peptides in the context of MHC class I molecules by cytotoxic T lymphocytes (CTL) is a key event in the elimination of virus-infected cells. It's generally accepted that recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors are nonpathogenic, replication-deficient, and elicit very weak immune responses, multiple clinical gene therapy trials have been carried out using AAV vectors. Nevertheless CTL responses to AAV capsid antigen and/or transgene products remain a major road block to achieve persistent therapeutic correction for clinical application. We try to develop a novel recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector that incorporate microRNA (miRNA) sequences targeting the ERAP1 gene while also driving the expression of transgene, thus achieving concomitant ERAP1 knockdown and expression of transgene. The new rAAV vector should specifically down-regulates ERAP1 expression during rAAV transduction. Accordingly, the trimming of rAAV-derived peptides is inhibited, leading to reduced susceptibility of transduced cells to rAAV-specific CTLs. We will optimize the dual-function rAAV vector to silence ERAP1in the rAAV transduced cells effectively at first, then verify whether the transgenic antigen processing and presentation in the target cells, and the rAAV-specific CTL activation is effectively inhibited. Notably, the possibility of specific silencing ERAP1 with this dual function rAAV vector might provide bases for innovative gene therapy in the future.

内质网氨基肽酶（ERAP）沉默是病毒免疫逃逸的常用策略。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别具有免疫优势的抗原决定簇，是细胞免疫应答的关键。ERAP沉默可抑制抗原决定簇的加工，CTL不能有效识别病毒感染细胞，导致病毒免疫逃逸。重组腺相关病毒（rAAV）载体是最佳基因治疗载体之一，但细胞免疫毒性限制了其广泛应用。本项目借鉴以上病毒免疫策略，设计可以同时表达转基因与miRNA的新型双功能rAAV载体。在正常表达转基因的前提下，miRNA的表达可以选择性沉默ERAP，从而改变潜在抗原肽在细胞内的加工及递呈。CTL不能识别rAAV转导阳性细胞，因而可降低细胞免疫毒性的风险。本课题首先将对该双功能载体的ERAP1沉默元件进行优化，然后通过细胞及动物实验，验证靶细胞内转基因抗原的加工及递呈是否得以有效抑制，是否可以抑制rAAV转导阳性细胞对CTL的激活，以期为今后开发更安全有效的rAAV载体奠定基础。

重组腺相关病毒（rAAV）因具有无致病性、低免疫原性、能介导外源基因长期表达、宿主范围广泛等优点，迅速成为最有发展前景的基因治疗载体，但临床研究发现的细胞免疫毒性成为制约其临床疗效的关键。在总结前人报道和自身实验数据的基础上，本课题组认为靶基因产物在体细胞内的抗原呈递激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可能是rAAV细胞免疫毒性的重要因素。考虑到内质网氨基肽酶（ERAP）沉默是病毒免疫逃逸的常用策略，本课题将ERAP沉默技术结合至rAAV载体的设计中，制备了同时表达转基因与miRNA的新型双功能rAAV载体。.本课题取得的重要成果如下：.1.优化了rAAV载体的生产工艺，每升培养基中表达水平达10E+15vg，为制备高纯度、高滴度的rAAV载体奠定了基础。.2. 细胞学实验表明：①所设计的双功能rAAV载体既可以正常表达转基因，又可以选择性沉默ERAP的表达。②以OVA为转基因产物，证明了所设计的双功能rAAV载体通过选择性沉默ERAP，抑制了OVA抗原肽的加工及递呈过程。③以OVA为转基因产物，证明所设计的双功能rAAV载体可以抑制rAAV转导阳性细胞对CTL的激活。.3. 以肝靶向性rAAV8为载体，以OVA为转基因，进行了体内实验。结果证明：①所设计的双功能rAAV8载体可以有效抑制OVA抗原肽在肝及脾脏内的加工及递呈，OVA专属性CTL的激活明显得到抑制。②在高剂量给药条件下，转基因产物OVA的表达，可以诱导OVA专属性CD4+ T细胞的增殖。③所诱导增殖的OVA专属性CD4+中，CD4+CD25+FoxP3+T细胞的比例明显增加。提示所设计的双功能rAAV载体既可以抑制rAAV转导阳性细胞对CTL的激活，又有可能诱导免疫耐受。.科学意义：.本课题利用miRNA在细胞中选择性阻断基因表达的特点，构建含有靶向ERAP1的miRNA和目的基因的rAAV载体，通过阻断转基因抗原在体细胞内的加工和呈递，既可以抑制对CTL细胞的激活，又有可能诱导免疫耐受，将为临床应用时避免或减轻rAAV细胞免疫毒性反应提供新的解决思路。