水稻白叶枯病菌和条斑病菌hrp调控网络的解析与比较研究

水稻白叶枯病和条斑病是我国水稻生产上的重要细菌病害。hrp基因决定着病原菌在水稻上的致病性，hrp网络调控系统是揭示决定着两个致病变种在水稻上致病性本质的关键切入点。本项目拟代表性构建hrp::gfp融合诱导表达系统，运用miniHimar RB1转座子构建高通量的突变体库，通过荧光流式细胞分流仪测定gfp表达水平，筛选新的控制hrp基因表达的调控元件，探索水稻来源的信号分子激活hrp基因表达的本质，分析调控元件对于细菌毒性的贡献，绘制精细的毒性调控网络；同时拟以白叶枯病菌和条斑病菌的hrpG和hrpX突变体为出发菌，通过基因芯片技术筛选受HrpG和HrpX调控的T3Se，比较两个致病变种T3Se的种类和数量差异，为揭示水稻黄单胞菌两个致病变种的致病性差异和侵染水稻组织的特异性提供科学依据，并为植物病原细菌病害的控制提供新策略。

为准确在水稻黄单胞菌中进行致病相关基因的转录表达和调控分析，本项目构建了包含终止子、gusA报道基因和多克隆位点等启动子探针元件的载体pUTG01和pUTG14，建立了高效的hrp基因诱导表达体系。以Xoo的hrpG、hrpX和hrpF基因为目的基因,利用miniHimar RB1转座子构建高通量的突变体库，获得hrpG负调控子7个，hrpX正调控子2个，hrpF负调控子7个，正调控子12个。为了系统化和全面性筛选受HrpG和HrpX调控的基因，制备了Xoo（PXO99A）和Xoc（RS105）菌株及其hrpG和hrpX突变体的基因芯片。在Xoo的hrpG和hrpX突变体中下调表达的基因中，鉴定了一个酮戊二酸转运通道蛋白KgtP，证明KgtP是III型效应分子；从III型分泌系统的分泌不依赖于出口控制蛋白HpaB,且定位与植物细胞膜上；在Xoo中缺失kgtp基因降低了病原菌的毒性和在寄主水稻组织中的生长。在Xoc基因芯片中，从29个含有PIP-box结构域的候选基因中，借助AvrXa10的报道系统，鉴定了2个新的T3SE效应蛋白XopAU和XopAV。XopAU不依赖HpaB和HpaP进行分泌，而XopAV的分泌受HpaB而不受HpaP的控制。xopAU和xopAV基因受XOM3诱导表达，xopAU受HrpD6负调控以及HrpG 和HrpX的正调控；xopAV受HrpD6、HrpG和HrpX的负调控。本项目构建了Xoryp_08180的缺失突变体，其显著降低了病原菌在水稻上的毒性以及在水稻组织中的生长能力,降低了胞外蛋白酶的活性。在植物中Xoryp_08180 的表达受HrpG和HrpX正调控。这些证据揭示Xoryp_08180 是Xoc胞外蛋白酶活性、HR的产生以及细菌全毒性所必需的。在Xoc突变体库中发现果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FbaB）突变体降低了胞外多糖（EPS）的产量及细菌在水稻上毒性。fbaB受植物源信号诱导表达，同时受hrp调控子HrpG和HrpX的负调控，但是fbaB的缺失抑制了hrpG和hrpX的表达，hrcC、hrpE和hpa3的转录反而增强，对其余的hrp-hrc-hpa基因表达没有影响。这是第一次报道Xoc的糖代谢基因在调节hrp基因的表达上起重要作用。项目执行期间，发表SCI论文2篇，中文核心期刊论文2篇，另2篇中文核心期刊论文已接受。